2.3.6.1. Chuẩn bị
- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh, có khối l−ợng 18– 20g/con.
- Canh khuẩn nuôi cấy các giống vi khuẩn Salmonella, bồi d−ỡng ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
- Dụng cụ: dao, kéo, kim tiêm, nhiệt kế, cồn, bông, màu đánh dấu, bút ghi và giấy trắng.
2.3.6.2. Tiến hành
Vi khuẩn Salmonella đ−ợc cấy vào môi tr−ờng n−ớc thịt, bồi d−ỡng ở 370C trong 24 giờ, sau đó tiêm vào phúc xoang 0,2 ml canh khuẩn của mỗi chủng vi khuẩn Salmonella cho chuột nhắt trắng (mỗi chủng tiêm 2 chuột). Theo dõi triệu chứng và thời gian chết của chuột trong 7 ngày. Chuột chết đ−ợc tiến hành mổ khám bệnh tích, nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ máu tim.
2.3.7. Ph−ơng pháp định type huyết thanh học các chủng Salmonella phân lập đ−ợc lập đ−ợc
2.3.7.1. Xác định nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đa giá
Sử dụng phản ứng ng−ng kết nhanh với kháng nguyên sống trên phiến kính (Slide agglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn
Salmonella.
+ Chuẩn bị:
- Khuẩn lạc vi khuẩn đ−ợc nuôi cấy vào thạch MacConkey hoặc thạch
0 h
máu nuôi d−ỡng trong tủ ấm ở nhiệt độ 37P PC trong 24P P. - Kháng huyết thanh chuẩn đa giá.
- Que cấy vô trùng, phiến kính sạch, bông cồn, n−ớc sinh lý. + Tiến hành:
- Dùng 1 phiến kính sạch chia làm 2 phần: 1 bên đối chứng, 1 bên thí nghiệm.
o
- Dùng ống hút Pasteur hoặc que cấy vô trùng lấy n−ớc sinh lý nhỏ mỗi bên 1 giọt.
- Dùng que cấy vô trùng lấy 1 ít khuẩn lạc điển hình của Salmonella
trên môi tr−ờng MacConkey hoặc thạch máu trộn đều với mỗi giọt n−ớc sinh lý đ8 nhỏ sẵn ở 2 bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên.
- Dùng ống hút Pasteur hoặc que cấy lấy huyết thanh đa giá nhóm O nhỏ vào huyễn dịch kháng nguyên đ8 chuẩn bị ở bên thí nghiệm. Còn bên đối chứng nhỏ 1 giọt n−ớc muối sinh lý (đối chứng âm) và trộn đều. Sau1 – 2 phút đọc kết quả.
+ Kết quả: Phản ứng d−ơng tính khi có cụm ng−ng kết xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Đối chứng âm vẫn đục đều. Nếu hỗn hợp cả 2 đầu phiến kính d−ơng tính thì vi khuẩn tự ng−ng kết; phải làm lại.
2.3.7.2. Xác định Serotype kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đơn giá
+ Chuẩn bị:
- Chọn những chủng Salmonella đ8 ng−ng kết với kháng huyết thanh đa giá nhóm O.
- Kháng huyết thanh đơn giá chuẩn, que cấy vô trùng, bông cồn, n−ớc sinh lý.
+ Tiến hành:
Chọn những chủng Salmonella đ8 ng−ng kết với kháng huyết thanh đa giá nhóm O; tiến hành làm phản ứng ng−ng kết nh− trên với tất cả huyết thanh O đơn giá thuộc nhóm đ8 ng−ng kết.
Chúng ng−ng kết với huyết thanh O đơn giá nào thì thuộc serotype O đó. Còn các serotype khác là có khả năng phản ứng chéo.
2.3.7.3. Ph−ơng pháp xác định kháng nguyên H Chuẩn bị:
- Chủng vi khuẩn đ−ợc cấy vào môi tr−ờng lỏng 2,5 ml để tủ ấm 37P PC qua đêm có lắc. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
o
o
Tiến hành:
- Cho vào ống type chứa 2,5 ml canh trùng đó 1 l−ợng t−ơng đ−ơng dung dịch Saline và Formol.
- Để ở nhiệt độ phòng 3 giờ.
- Lấy 1 ống type mới rồi cho vào đó 0,25 ml dung dịch và canh trùng ở trên, rồi cho thêm 0,25 ml kháng huyết thanh đ8 pha sẵn hoặc một giọt kháng huyết thanh H, để trong n−ớc nhiệt độ 50P PC trong 1 giờ.
Đọc kết quả.
- Phản ứng d−ơng tính là kháng huyết thanh và kháng nguyên kết hợp với nhau tạo kết bông rõ ở đáy ống nghiệm.
- Phản ứng âm tính khi không thấy kết tủa ở đáy ống nghiệm.
Với các b−ớc tiến hành ở trên ta đ8 xác định đ−ợc kháng nguyên H pha 1 của Salmonella.
Ph−ơng pháp xác định kháng nguyên H pha 2 của các chủng
Salmonella:
Chuẩn bị:
- ống nghiệm đựng 1,9 ml môi tr−ờng thạch có chứa 0,3% thạch. - Cho vào đó 0,1 ml kháng huyết thanh H
+ ống nuôi cấy S.typhimurium nhỏ kháng huyết thanh I
+ ống nuôi cấy S. enteritidis nhỏ kháng huyết thanh G complex - Cho vào ống nghiệm đó 1 ống thuỷ tinh nhỏ hở 2 đầu
- Cấy chủng vi khuẩn cần xác định bằng que cấy thẳng vào phía trong của ống thuỷ tinh nhỏ sâu khoảng 1 - 1,5 cm.
Để tủ ấm 37P PC qua đêm và đọc kết quả: phản ứng d−ơng tính thấy mọc chồi lên mặt thạch ở trong ống nh− là lông uốn cong; phản ứng âm tính thì chỉ nhìn thấy vi khuẩn mọc theo đ−ờng cấy chích sâu ở trong lòng ống thuỷ tinh.
Sau đây là cấu trúc kháng nguyên của 3 chủng Salmonella th−ờng gặp:
S. typhimurium O 1,4, [4], 12 Hi; 1,2
0
0
S. choleraesuis O 6, 7 Hc, 1,5