3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.5.Phương pháp theo dõi ảnh hưởng của các nồng độ tỏi đến sự phát triển
của noãn nang (Oocyst) cầu trùng trong phòng thí nghiệm
Phương pháp theo dõi ảnh hưởng của các nồng độ tỏi đến sự phát triển của noãn nang cầu trùng trong phân thỏ trong phòng thí nghiệm.
Tỏi trắng – Alium sativum L sau khi được mua từ nơi trồng huyện Kinh Môn - Hải Dương. Tỏi dùng trong đề tài được đảm bảo thu hoạch đúng thời vụ, phơi khô, bảo quản trên gác nhà và dưới mái hiên.
Hàng ngày, khi thu gom phân thỏ đang bị bệnh cầu trùng hay khi mổ khám những con có bệnh tích điển hình tại phòng thí nghiệm (chúng tôi lấy thêm phân ở manh tràng thỏ bệnh). Tiến hành cân 30 gam phân hay phân của manh tràng thỏ bệnh cho vào đĩa lồng đường kính 20cm. Tùy theo nồng độ tỏi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
thí nghiệm để tính lượng tỏi cho vào đĩa lồng. Trộn tỏi đã được nghiền mịn với phân thỏ. Chú ý, trộn thật đều rồi dàn phẳng trong đĩa theo tỷ lệ 2,5%, 5,0%, 7,5% và 10,0% hay 0,06 mg anticoc/đĩa phân (pha thành dung dịch10%). Trong thí nghiệm này chúng tối sử dụng dung dịch kalibicromat nồng độ 2,5% cho vào mỗi đĩa lồng thí nghiệm 5,0ml để ức chế sự phát triển của nấm.
Tiến hành bố trí thí nghiệm theo bảng sau:
Ký hiệu số đĩa 1 2 3 4 5 6 Lượng phân thỏ bệnh (g/đĩa) 30,0 Kalibicromat2,5% (ml/đĩa) 5,0 Nồng độ tỏi (% /P của đĩa) 2,5 5,0 7,5 10,0 - Dung dịch anticoc 1% (ml/đĩa) - - - - - 0,6ml
Sau đó cứ cách 12 giờ, chúng tôi lại lấy 3 g phân của từng đĩa với các nồng độ tỏi khác nhau để làm xét nghiệm và theo dõi sự phát triển của noãn nang cầu trùng. Dựa và số lượng noãn nang cầu trùng có mặt trong vi trường chưa được phân bào và sự nguyên vẹn của lớp vỏ bao ngoài noãn nang để đánh giá sự ảnh hưởng của các nồng độ tỏi khác nhau và thuốc five – anticoc. Thí nghiệm được kéo dài đến 96 giờ. Phương pháp xét nghiệm phân để quan sát sự phân bào và vỏ noãn nang được tiến hành như sau:
* Phương pháp thu gom noãn nang Oocyst cầu trùng trong phân thỏ.
Nguyên lý thu Oocyst: Dựa vào sự chênh lệch tỉ trọng riêng của Oocyst cầu trùng với dung dịch làm nổi, dùng nước muối bão hòa và hiệu ứng vận tốc quay li tâm để tách Oocyst theo trình tự:
+ Thu Oocyst: Phân chứa Oocyst được hòa với nước muối bão hòa gấp 10 lần, khuấy tan phân trong dung dịch, sau đó lọc qua lưới lọc loại bỏ cặn thô. Huyễn dịch thu được cho vào máy li tâm 500 vòng/phút/5 phút, lấy phần nước phía trên có chứa Oocyst. Tách Oocyst ra khỏi dung dịch nước muối bão hòa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
bằng cách cho thêm nước cất với lượng tương đương, sau đó cho vào máy quay li tâm với tốc độ 3000 vòng/10 phút, gạn bỏ nước đi, thu Oocyst ở đáy ống nghiệm.
+ Rửa Oocyst: Thêm nước cất vào ống ly tâm, khuấy tan cặn có Oocyst, cho vào máy quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút/5 phút. Gạn nước giữ lại phần cặn, làm lặp lại 2 lần, thu Oocyst. Tiếp tục thêm 3ml nước cất vào lắc đều, dùng pipét hút dịch trên nhỏ lên buồng đếm Mc. Master. Kiểm tra trên kính hiển vi để tìm Oocyst cầu trùng và quan sát sự phát triển phân bào của noãn nang cầu trùng theo thời gian của từng nồng độ tỏi.
Cân 3g phân cần xét nghiệm cho vào cốc sạch, đổ nước muối bão hòa vào, dùng đũa thủy tinh khuấy cho phân tan (lượng nước muối nhiều hơn lượng phân 10-20 lần), sau đó lọc qua lưới thép bỏ cặn. Lấy dung dịch vừa lọc được cho vào ống nhỏ, để yên tĩnh trong 20-30 phút. Dùng vòng thép vớt màng mỏng trên bề mặt, cho lên phiến kính quan sát dưới kính hiển vi, hoặc có thể đổ dung dịch vừa lọc vào ống nghiệm đầy đến tận miệng, đậy phiến kính lên trên sao cho tiếp xúc với dung dịch. Để khoảng 20-30 phút, sau đó lấy phiến kính ra soi trên kính hiển vi để tìm Oocyst cầu trùng và quan sát sự phát triển phân chia của noãn nang cầu trùng.
Mỗi thí nghiệm được làm lặp lại 3 lần (n=3).