1.4 .CƠ CHẾ BỆNH SINH BỆNH BẠCH CẦU CẤP
1.7. CÁC YẾU TỐ CÓ GIÁ TRỊ TIÊN LƢỢNG TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH
BẠCH CẦU CẤP
Trong điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho có một số yếu tố liên quan đến tiên lƣợng đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu và đề cập đến nhƣ độ tuổi, thể bệnh, các biến đổi di truyền …
Theo nghiên cứu của Hoffbran A.V., bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có tiên lƣợng tốt là những bệnh nhân có các yếu tố: Giới: nữ, số lƣợng bạch cầu thấp, trẻ nhỏ (trên 2 tuổi), bệnh bạch cầu cấp dòng lympho B, bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46XX/XY, hoặc quá bội- có trên 50 NST, có chuyển đoạn gen TEL[86]. Robert McKenna cho rằng, bệnh nhân bạch cầu
cấp dòng lympho có chuyển đoạn t(12;21), cũng là những bệnh nhân thuộc nhóm tiên lƣợng tốt [103]. Những bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có tiên lƣợng xấu theo Hoffbran là những bệnh nhân nam, lớn tuổi, hoặc bệnh nhi dƣới 2 tuổi, bạch cầu cấp dòng lympho T, bệnh nhân có NST Ph1 dƣơng tính, có chuyển đoạn 11q23 [86]. Theo Robert M., ngoài các yếu tố trên có một số bất thƣờng di truyền khác có giá trị tiên lƣợng bệnh nhƣ các chuyển đoạn gen MLL-AF4, E2A-PBX [103].
Gần đây, Yocum và cộng sự trong các nghiên cứu về protein cũng nhận thấy các biểu hiện quá mức hoặc sự có mặt của nhiều protein bất thƣờng, protein đột biến, protein lai cũng có ảnh hƣởng đến quá trình đáp ứng thuốc của bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho [148].
Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ tỷ lệ tế bào non ác tính trong 1 tuần và sau 4 tuần sau khi dung thuốc đều đƣợc các tác giả đề cập tới là một trong các yêu tố tiên lƣợng bệnh. Hoffbran nhận thấy, những bệnh nhân không còn tế bào non ác tính ngoài máu ngoại vi sau 1 tuần điều trị và đạt lui bệnh hoàn toàn sau 4 tuần điều trị có tiên lƣợng bệnh tốt hơn so với nhóm bệnh nhân sau 4 tuần điều trị vẫn còn nhiều tế bào non ác tính.
1.8. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÕNG LYMPHO Ở VIỆT NAM
Từ những năm 1974, đã có những nghiên cứu về bệnh bạch cầu cấp ở Việt Nam. Theo Nguyễn Thị Minh An, Vũ Thị Minh Châu và cộng sự (1996), Trần Minh Hƣơng (2000), tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp ngày càng tăng [1][8].
Năm 1977, Đặng Ngọc Tiêu và cộng sự đã đƣa ra những nhận xét về bệnh bạch cầu cấp đầu tiên tại bệnh viện Bạch Mai [22]. Năm 1980, Bạch Quốc Tuyên, Đỗ Xuân Thiêm, đã đƣa ra bộ xét nghiệm hóa học tế bào để chẩn đoán bệnh BCC theo tiêu chuẩn FAB đầu tiên ở Việt Nam, và vẫn đƣợc
sử dụng cho đến hiện nay, trong chẩn đoán ban đầu bệnh [24].
Trong những năm tiếp theo của thập kỉ 80, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Công Khanh, Dƣơng Bá Trực đã đƣa ra các phân loại bệnh BCC ở bệnh nhân BCC đƣợc điều trị tại Huế, bệnh nhi đƣợc điều trị tại Viện Nhi trung ƣơng [10] [15]. Năm 2004, Lâm Thị Mỹ, Trần Thái Bình, Huỳnh Nghĩa đã đƣa ra những nhận xét về đặc điểm bệnh BCC ở khu vực phía Nam [16]. Cũng trong năm 2004, Bạch Quốc Khánh, Nguyễn Hà Thanh, Đỗ Trung Phấn đã đƣa ra nhận xét về đặc điểm bệnh BCC dòng lympho ngƣời lớn tại Viện Huyết học- Truyền máu Trung ƣơng [11].
Trong những năm 1990, với sự phát triển của kĩ thuật miễn dịch huyết học, phân loại bệnh BCC dựa vào các dấu ấn trên màng tế bào bắt đầu đƣợc ứng dụng tại Việt Nam. Năm 1997, Trần Văn Bé, Lê Hữu Tài đã tổng kết phân loại bệnh nhân bạch cầu cấp bằng miễn dịch [2]. Trần Quốc Dũng, Phan Nguyễn Thanh Vân (2001) [5], Trần Thị Hồng Hà (2007) [6], và Nguyễn Triệu Vân (2009) [27], đã đƣa ra các nhận xét, đánh giá, và các đặc điểm dấu ấn miễn dịch dùng trong phân loại bệnh BCC.
Năm 1980, khi bắt đầu nhuộm Giemsa nhiễm sắc thể và sau đó là nhuộm băng NST, các bất thƣờng tế bào di truyền ở bệnh BCC đã đƣợc ghi nhận. Năm 1986, Nguyễn Ngọc Minh đã đƣa ra các nhận xét về tổn thƣơng tế bào di truyền ở bệnh nhân BCC tại Huế [15]. Năm 1997, Trần Thị Hồng Hà, Phan Thị Phi Phi, Nguyễn Công Khanh và cộng sự đã đƣa ra nhận xét về một số đặc điểm sinh học liên quan đến tiên lƣợng ở bệnh nhân BCC dòng lympho trẻ em [6]. Năm 2003, Phạm Quang Vinh đã có con số thống kê cụ thể các bất thƣờng nhiễm sắc thể trên 200 bệnh nhân BCC dòng tủy và dòng lympho [30]. Năm 2007, Bùi Ngọc Lan cộng sự đã đƣa ra nhận xét về các biến đổi di
truyền ở bệnh nhi BCC dòng lympho [12]. Năm 2007, Nguyễn Thiên Lữ, Phạm Quang Vinh đã sử dụng kĩ thuật FISH, PCR để có kết quả đầu tiên về biến đổi gen BCR/ABL [14]. Năm 2009, Vũ Minh Phƣơng, đã đƣa nghiên cứu về một số biến đổi gen đăc trƣng và đáp ứng điều trị ở bệnh nhân BCC dòng tủy [21].
Các nghiên cứu về protein bắt đầu muộn hơn, năm 2004, Vũ Minh Thành, Phan Văn Chi [144], đã đƣa ra những báo cáo đầu tiên về protein lai ở bệnh nhân BCC dòng lympho. Năm 2006, Trịnh Thị Thanh Hƣơng, Trịnh Hồng Thái trong nghiên cứu của mình, đã nhận diện sự có mặt của một số protein bất thƣờng ở bệnh nhân BCC [137].
Năm 2009, Phan Văn Chi đã đƣa ra những nghiên cứu về protein bệnh và đột biến trong huyết thanh bệnh nhân BCC [4]. Năm 2010, Phan Văn Chi đã báo cáo kết quả nghiên cứu về dữ liệu ngân hàng protein huyết thanh ngƣời Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh ung thƣ máu [4].
Tuy nhiên, các báo cáo về các biến đổi gen, về biến đổi hệ protein ở bệnh nhân bạch cầu cấp nói chung và bệnh bạch cầu cấp dòng lympho nói riêng còn ít và chƣa hệ thống. Với sự phát triển nhanh của công nghệ sinh học, cần có nhiều công trình đi sâu nghiên cứu về sự biến đổi các bất thƣờng gen, các bất thƣờng hệ protein, góp phần nâng cao chất lƣợng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. ĐỐI TƢỢNG
2.1.1. Số lƣợng
- Số lƣợng : 66 bệnh nhân đƣợc điều trị tại khoa Huyết học Truyền máu và khoa Nhi, bệnh viện Bạch Mai.
- Độ tuổi:
+ Trẻ em dƣới 15 tuổi: 12. + Ngƣời trƣởng thành: 54.
- Thời gian: từ tháng 03 năm 2008 đến tháng 12 năm 2010.
2.1.2. Tiêu chuẩn
+ Bệnh nhân chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp, đƣợc điều trị tại khoa Huyết học - Truyền máu, khoa Nhi - bệnh viện Bạch Mai.
+ Có chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp dòng lympho bằng hình thái, hóa tế bào, miễn dịch huyết học.
+ Bao gồm cả hai giới nam và nữ.
- Phác đồ điều trị hóa chất cho bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho đã sử dụng trong nghiên cứu:
Doxorubicin + Vincristin + Prednisolon ± Cyclophosphamid
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Máu ngoại vi. - Dịch tủy sinh máu.
2.3. PHƢƠNG PHÁP
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả, tiến cứu.
2.3.2. Nội dung và các chỉ số nghiên cứu
- Nghiên cứu các đặc điểm tế bào máu và tủy trƣớc và sau điều trị, các yếu tố ảnh hƣởng đến tiên lƣợng bệnh bạch cầu cấp.
+ Các chỉ số tế bào máu ngoại vi và tủy xƣơng. + Mật độ tế bào tủy xƣơng.
+ Tỷ lệ tế bào non ác tính trong máu và tủy.
- Nghiên cứu các biến đổi gen BCR/ABL, AML1/TEL, MLL/AF4, E2A/PBX, kiểu biến đổi từng gen, khả năng lui bệnh.
- Nghiên cứu các biến đổi protein ở 5 bệnh nhân BCC dòng lympho, có bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng, liên hệ với các đặc điểm lâm sàng, đánh giá tiên lƣợng.
2.3.3. Các nhóm đối tƣợng nghiên cứu
- Nhóm 1: nghiên cứu đặc điểm máu và tủy bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng lympho trƣớc và sau điều trị hóa chất.
+ Nhóm 1a: trƣớc điều trị hóa chất. + Nhóm1b: sau điều trị hóa chất.
- Nhóm 2: các bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho có 4 chuyển đoạn gen E2A/PBX, BCR/ABL, AM1/TEL, MLL/AF4.
- Nhóm 3: 05 bệnh nhân không có bất thƣờng di truyền đƣợc phân tích các biến đổi của hệ protein trƣớc điều trị.
2.4. KĨ THUẬT
2.4.1. Kĩ thuật huyết tủy đồ, chẩn đoán bênh bạch cầu cấp dòng lympho
2.4.1.1. Hóa chất
- Cồn tuyệt đối.
- Giemsa Wright: nhuộm hình thái tế bào.
- Dung dịch Periodic 1%, Acid Shiff, formol 10%, Hematoxylin: nhuộm kĩ thuật hóa tế bào PAS, chẩn đoán sơ bộ BCC dòng lympho. Dung dịch Peroxydase 5% để loại trừ các tế bào non ác tính dòng tủy.
- Các marker xác định dấu ấn trên bề mặt tế bào:
+ Dòng B lympho: CD10, CD19, CD20, CD22, CD79a + Dòng T lympho: CD 2, CD3, CD5, CD7.
Các thuốc nhuộm CD, đã gắn huỳnh quang, hãng Beckton Dickenson, Mỹ.
2.4.1.2. Trang thiết bị
- Kim chọc hút dịch tủy. - Các cóng nhuộm.
- Kính hiển vi CX41, hãng Olympus- Nhật Bản.
- Máy đếm tế bào lase tự động 32 thông số XT-2000i, hãng Sysmex, Nhật Bản.
- Máy phân tích BD Canto II, hãng Beckton Dickenson, Mỹ.
2.4.1.3. Kĩ thuật huyết tủy đồ, CD chẩn đoán phân loại bệnh
- Chọc hút dịch tủy tại gai chậu sau trên.
- Đếm số lƣợng tế bào có nhân tại tủy bằng máy đếm tế bào tự động, làm tiêu bản [57].
- Nhuộm Giemsa và hóa tế bào để chẩn đoán sơ bộ thể bệnh theo tiêu chuẩn hình thái FAB, dựa vào đặc điểm hình thái các tế bào non ác tính.
Bệnh nhân có trên 20% tế bào non ác tính trong tủy xƣơng đƣợc chẩn đoán là bệnh bạch cầu cấp (tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới đƣa ra năm 2001, sửa đổi 2006, 2008 cần có 20% tế bào có nhân trong tủy là tế bào non ác tính, bệnh nhân đƣợc chẩn đoán là BCC).
Các tế bào tế bào non ác tính dòng lympho với nhuộm hóa tế bào PAS- periodic acid shiff sẽ dƣơng tính, phân biệt với các tế bào non ác tính dòng tủy, khi nhuộm Peroxidase sẽ dƣơng tính [57].
Đặc điểm hình thái tế bào non ác tính bệnh nhân BCC dòng lympho khác nhau giữa các thể bệnh và đã đƣợc thống kê tại tại bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái các thể bệnh BCC dòng lympho [134]
Đặc điểm/ Thể bệnh
Kích thƣớc Nhân Nguyên sinh chất
L1 Chủ yếu tế bào nhỏ, tƣơng đối đồng đều
Lƣới mầu nhân khá mịn, đôi khi có rãnh, có khía. Hầu nhƣ không rõ hạt nhân
Hẹp
Ƣa bazơ nhẹ
L2 Tế bào to, kích thƣớc không đều
Lƣới màu nhân thô, không đều. Có hạt nhân Thay đổi, rộng vừa. ƣa bazơ đậm L3 Tế bào kích thƣớc lớn, tƣơng đối đều.
Lƣới nhân thô.
Có một hoặc nhiều hạt nhân Thƣờng có hốc trong nhân
Rộng
Ƣa bazơ mạnh Có hốc trong nguyên sinh chất
- Sau đó, tiến hành phân loại dòng tế bào T hay B lympho dựa vào các dấu ấn miễn dịch trên bề mặt.
tế bào có nhân trong dịch tủy.
+ Li tâm, tách bạch cầu, ủ gắn với các CD.
+ Máy đọc và phân tích dựa trên tính phát màu của các CD.
Phân nhóm bệnh BCC dựa trên dấu ấn miễn dịch trên bề mặt màng tế bào non ác tính nhƣ bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào dòng lympho [72] [129]
Marker CD trên bề mặt Dòng B lympho Dòng T lympho
CD10 +/- - CD19 + - CD20 + - CD22 + - CD79a + - CD7 - + CD3 - + CD5 - + CD2 - + CD4/CD8 - +/-
2.4.2. Kĩ thuật phân tích tế bào di truyền
2.4.2.1. Hóa Chất
- Heparin 5000UI/ml.
- Môi trƣờng nuôi cấy RPMI. - Chất kích thích phân bào PHA.
- Huyết thanh nhóm AB: để nuôi cấy tế bào.
- Dung dịch Colchimid, muối citrate: nhuộm băng G nhiễm sắc thể.
- Kính hiển vi Nikon. - Tủ nuôi cấy CO2.
2.4.2.3. Kĩ thuật nuôi cấy tế bào và phân tích nhiễm sắc thể
- Sau khi nuôi cấy, kích thích sự phân chia nhiễm sắc thể, làm tiêu bản, nhuộm giemsa.
- Xác định số lƣợng nhiễm sắc thể trong các cụm phân bào, tìm các bất thƣờng về số lƣợng nhiễm sắc thể.
- Nhuộm băng G, phát hiện các chuyển đoạn nhiễm sắc thể [63][102].
2.4.3. Kĩ thuật PCR
2.4.3.1. Hóa chất
- dNTP: các nucleotit tự do, để tổng hợp sợi đơn DNA. - Taq DNA: enzyme tách sợi đôi DNA ban đầu để nhân gen. - MgCl2: ion hoạt hóa.
- Primer- Mồi xuôi và ngƣợc:dùng để tổng hợp đoạn DNA đặc trƣng cho các đột biến. Trình tự các mồi (lựa chọn cặp mồi có tần xuất gặp nhiều nhất) [140].
A, Cặp mồi cho chuyển đoạn t(8;21)(q23;p13), đặc trưng bởi chuyển đoạn gen E2A/PBX
E2A-A : CACCAGCCTCATGCACAAC PBX-B : TCGCAGGAGATTCATCACG E2A-C : CACCCTCCCTGACCTGTCT PBX-D : GGCCTGCTCGTATTTCTCC PBX-E3: TGAACTTGCGGTGGATGAT
B, Chuyển đoạn gen MLL/AF4
MLL-A : CCGCCTCAGCCACCTAC AF4-B : TGTCACTGAGCTGAAGGTCG
MLL-C : AGGACCGCCAAGAAAAGA AF4-D : CGTTCCTTGCTGAGAATTTG MLL-E5: AAGCCCGTCGAGGAAAAG
C, Chuyển đoạn gen AML1/TEL:
AML1-A : CTACCGCAGCCATGAAGAACC TEL-B : AGAGGAAGGCCCATTGCTGAA AML1-C : ATGACCTCAGGTTTGTCGGTCG TEL-D : TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCT AML1-E : TGGCTGGCAATGATGAAAACTACT
D, Chuyển đoạn gen ABL/BCR
BCR-e1-A: GACTGCAGCTCCAATGAGAAC ABL-a3-B: GTTTGGGCTTCACACCATTCC BCR-e1-C: CAGAACTCGCAACAGTCCTTC ABL-a3-D: TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA ABL-a3-E: TGACTGGCGTGATGTAGTTGCTT
* Trình tự mồi được lấy theo nghiên cứu của Van Dongen J. và cộng sự
[140].Mồi đƣợc đặt tại mua tại hãng Invitrogen, Mỹ.
- Thạch Agarose 1.5%, Invitrogen, Mỹ.
- Loading dye: dung dịch hiển thị màu, Biorad, Mỹ.
- Dung dịch nhuộm màu điện di: Ethidium Bromide, Invitrogen, Mỹ. - DNA chuẩn, 100bp, Invitrogen, Mỹ.
- Kit tách chiết RNA từ huyết tƣơng, GE heath, Thụy Điển. - Dung dịch điện di TBE 1x: Invitrogen, Mỹ.
- Chứng dƣơng, chứng âm: đƣợc cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu bệnh dịch khu vực Châu Á- Thái Bình Dƣơng Namru II, Indonesia.
2.4.3.2 Trang thiết bị
- Máy li tâm tốc độ cao, Eppendoft, Đức. - Máy li tâm thƣờng: Kubota, Nhật Bản.
- Máy biến đổi nhiệt (Thermo cycle): 96 giếng, Biorad, Mỹ. - Bể điện di Biorad.
- Bàn có đèn UV light đọc kết quả điện di, Biorad, Mỹ. - Vortex, AppliBiosystem, Mỹ.
- Tủ pha hóa chất vô trùng: Sanyo, Nhật Bản. - Máy chụp ảnh gen Polar, Mỹ.
2.4.3.3. Kĩ thuật RT-PCR
- Bệnh phẩm: 1ml dịch tủy xƣơng. - Li tâm 5000v/phút x 10 phút. - Tách lấy huyết tƣơng.
- Cho 100µl huyết tƣơng vào chính giữa ống cột lọc.
- Dùng dung dịch rửa 1 và 2 để rửa sạch, và phá vỡ màng bạch cầu. - Li tâm tốc độ 13.000v/p x 5 phút.
- Kit tách chiết sử dụng cột lọc có lƣới silica, kết dính sợi ARN, sau đó dùng 50µl dung dịch tách để tách các sợi ARN ra khỏi lƣới. Li tâm 13.000v/phút x 3 phút, các ARN sẽ tách ra khỏi lƣới silica, rơi xuống tuýp eppendoft.
- Dùng 20µl sản phẩm tách chiết đƣợc để sử dụng cho quá trình khuyếch đại cùng các dNTP, mồi, MgCl2, H2O, Taq polymerase vừa đủ 50µl.
- Thực hiện chu trình biến đổi nhiệt: + PCR nhiệt độ và thời gian chu kỳ. • Ban đầu tan : 95 ° C trong 30 giây.
• Chu trình biến đổi nhiệt PCR. 94 ° C trong 30 giây : dãn xoắn. 65 ° C trong 60 s (gắn mồi).
72 ° C trong 60 s ( tổng hợp chuỗi). • Số chu kỳ lặp lại: 35.
• Kết thúc PCR: 16 ° C (hoặc nhiệt độ phòng). + Vòng PCR thứ hai lồng PCR: Nested PCR. • 1 ml của vòng PCR đầu tiên.
• Cùng một khối lƣợng, hóa chất và các điều kiện chu kỳ cho lần đầu tiên vòng PCR.
- Sản phẩm của các quá trình khuyếch đại đƣợc lấy 5µl trộn với 1µl dung dịch nhuộm màu- loading dye, trên giấy paraffin.
- Thạch agarose 1.5%: 100mg, hòa tan trong 100ml nƣớc cất, đun sôi, đổ khuôn, để nguội, tạo giếng điện di.
- Nhỏ sản phẩm khuyếch đại đã trộn thuốc nhuộm màu vào giếng. - Điện di một chiều trong dung dịch TBE [140].
- Đọc kết quả trên UV light.