Nhƣ đã đề cập trong phần tổng quan tài liệu và phần phƣơng pháp nghiên cứu, ở exon 16 của gene ACTN3 R577X có một đột biến điểm C→T làm thay
đổi một bộ ba mã hóa CGA thành TGA (mã kết thúc). Đồng thời, trình tự nucleotide của alen R tại vị trí này là 5’ - CCNAG - 3’, ở alen X, nucleotide C bị đột biến thành T ở vị trí 577, khi đó trình tự chuyển thành 5’- CTNAG - 3’, đây chính là trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn DdeI.
Lợi dụng đặc điểm này, chúng tôi đã thiết kế đoạn mồi khuếch đại vùng gene có chứa điểm đột biến trên với một số cải tiến so với các nghiên cứu khác trên thế giới. Đó là, mở rộng vùng gene đƣợc khuếch đại theo hƣớng tăng kích thƣớc các sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme giới hạn DdeI để có thể phân biệt dễ dàng nhất các kiểu gene khác nhau (RR, RX, XX).
Cặp mồi 2ACTN3-F và 2ACTN3-R mà chúng tôi thiết kế đã thỏa mãn đƣợc các yêu cầu trên. Theo đó, trong đoạn trình tự 629 bp đƣợc khuếch đại sẽ có chứa 2 điểm cắt của DdeI đối với alen X và một điểm cắt của DdeI nếu là
alen R. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm khuếch đại gene ACTN3, cắt bằng
71 enzyme cắt giới hạn DdeI và điện di kiểm tra trên gel agarose sẽ đƣợc phân biệt bằng số băng và kích thƣớc băng điện di xuất hiện. Kiểu gene RR đặc trƣng với 2 băng có kích thƣớc 429 bp và 200 bp; kiểu gene RX đặc trƣng với 4 băng có kích thƣớc 429 bp, 332 bp, 200 bp và 97 bp; kiểu gene XX đặc trƣng với 3 băng có kích thƣớc 332 bp, 200 bp và 97 bp.
Dƣới đây là hình ảnh điện di của một số mẫu VĐV mà chúng tôi đã thu đƣợc, với quy trình thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ đã trình bày tại mục 2.2.5 (Hình 3.11).
Giếng M: Marker 100 bp; Giếng ký hiệu K: mẫu VĐV bộ môn chạy; Giếng ký hiệu B: mẫu VĐV bộ môn bơi lội
Nhƣ vậy, theo kết quả điện di có thể dễ dàng xác định: Các giếng có kiểu gene RR (xuất hiện 2 băng, có kích thƣớc 429 bp và 200 bp) nhận đƣợc từ các mẫu có ký hiệu là B11 và B14; các giếng có kiểu gene RX (đặc trƣng với 4 băng có kích thƣớc 429 bp, 332 bp, 200 bp và 97 bp) nhận đƣợc từ các mẫu có ký hiệu là K18, K19, K20, B10, B12, B13, B16, B17 và B18; các giếng có kiểu gene XX (có 3 băng với kích thƣớc 332 bp, 200 bp và 97 bp) nhận đƣợc từ các mẫu có ký hiệu là B9 và B15.
Với cách làm tƣơng tự nhƣ trên, chúng tôi đã xác định đƣợc kiểu gene
ACTN3 R577X của 54 VĐV điền kinh; 34 VĐV bơi lội và 40 mẫu đối chứng. Kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3. 6; Bảng 3. 7 và Bảng 3. 8.
72
Bảng 3. 6. Kết quả xác định kiểu gene ACTN3 R577X của các VĐV điền kinh
STT
Ký hiệu
mẫu Họ và tên Nội dung thi đấu Kiểu gene
1 K1 Đỗ Thị Thảo 800 m; 1500 m RR
2 K2 Dƣơng Văn Thái 800 m; 1500 m RR
3 K3 Ngô Đăng Thanh 800 m; 1500 m RX
4 K4 Vũ Thị Ly 800 m; 1500 m RX 5 K5 Nguyễn Văn Lý 1500 m; 3000 m RX 6 K6 Phạm Tiến Sản 1500 m; 3000 m XX 7 K7 Trƣơng Thanh Hằng 800 m; 1500 m RX 8 K8 Nguyễn Đặng Thanh Thúy 3000 m; 5000 m; 10000 m RX 9 K9 Phạm Thị Bình 10000 m; 21000 m; 42195 m XX 10 K10 Nguyễn Thị Thanh Phúc 5000 m; 10000 m; 20000 m RR 11 K11 Phan Thị Bích Hà 10000 m; 20000 m RR 12 K12 Nguyễn Thành Ngƣng 10000 m; 20000 m RX 13 K13 Võ Xuân Vĩnh 10000 m; 20000 m RX 14 K14 Nguyễn Văn Đức 800 m; 1500 m RX 15 K15 Hoàng Văn Dũng 1000 m; 1500 m RR 16 K16 Lê Viết An 1000 m; 1500 m RR 17 K17 Nguyễn Hoa Ri 800 m; 1500 m RX
18 K18 Trƣơng Thị Thúy Kiều 800 m; 1500 m; 3000 m; 5000
m RX
19 K19 Trần Thị Thắm 800 m; 1500 m; 5000 m RX
20 K20 Nguyễn Tuấn Trị 800 m; 1500 m; 3000 m RX 21 K21 Quách Thị Lan 400 m; 400 m rào; 200 m RR
22 K22 Phạm Thị Diễm Nhảy cao RR
23 K23 Quách Công Lịch 400 m RR
24 K24 Lê Trọng Hinh 100 m; 400 m RX
25 K25 Nguyễn Văn Công Nhảy xa; 200 m XX
26 K26 Nguyễn Văn Lai 5000 m, 10000 m RR
27 K27 Nguyễn Thị Oanh 100 m; 400 m; 400 m rào RX 28 K28 Nguyễn Thị Oanh 1500 m; 2000 m CNV; 3000 m
CNV; RX
73
30 K30 Nguyễn văn Mùa Nhảy xa RR
31 K31 Nguyễn Thị Huyền 400 m rào RR
32 K32 Vũ Thùy Trang 400 m; 200 m XX
33 K33 Đào Xuân Cƣờng 400 m rào; 4x400 m RR
34 K34 NguyễnThịThúy 100 m; 200 m; 400 m RR
35 K35 Đào Văn Thủy Nhảy cao RR
36 K36 Nguyễn Anh Tú 400 m rào; Tiếp sức 400 m RR
37 K37 Nguyễn Ngọc Quang 100 m rào RX
38 K38 Trần Thị Mai 1000 m; 1500 m; 3000 m RX
39 K39 Lê Văn Thao 1500 m; 5000 m; 10000 m RX
40 K40 Nguyễn Thị Hằng 400 m; 400 m rào RR
41 K41 Bùi Văn Đông Nhảy xa; Nhảy 3 bƣớc; 100 m RX
42 K42 Hoàng Văn Duy 400 m RR
43 K43 Hồ Xuân Tâm 400 m; tiếp sức 4x400 m RR
44 K44 Đinh Văn Tùng 400 m XX
45 K45 Trần Thanh Bình Nhảy cao RX
46 K46 Nguyễn Thị Quỳnh Nhảy cao RX
47 K47 Vũ Thị Mến Nhảy xa; Chạy tiếp sức
4x100 m RR
48 K48 ĐàoThị Kim Oanh Nhảy xa; Nhảy cao XX
49 K49 Nguyễn Thị Mộng Mơ Nhảy xa; Nhảy cao RR 50 K50 Nguyễn Trƣờng Giang Điền kinh; ném lao XX 51 K51 Dƣơng Thị Việt Anh Điền kinh; nhảy cao RX
52 K52 Vũ Thị Hƣơng Điền kinh 100 m; 200 m RR
53 K53 Nguyễn Thị Ngọc Thắm Điền kinh 4*100 m; 100 m RR
54 K54 Trần Huệ Hoa Nhảy 3 bƣớc RX
Bảng 3. 7. Kết quả xác định kiểu gene ACTN3 R577X của các VĐV Bơi lội
STT KH
mẫu Họ và tên VĐV Nội dung thi đấu của VĐV Kiểu gene
1 B1 Hoàng Quý Phƣớc 100 m E; 100 m TD RR
2 B2 Nguyễn Văn Đạt 50 m B; 50 m S; 100 m S RX
3 B3 Dƣơng Thị Thơm 100 m N RR
4 B4 Lê Thị Việt Trinh 50 m E; 100 m E; 200 m E RR 5 B5 Ngân Thị Nhiên 50 m E; 100 m E; 200 m E RR
74 7 B7 Nguyễn Duy Thiện 50 m B; 100 m B; 50 m S RX
8 B8 Vũ Tấn Thành 50 m TD; 100 mTD RX
9 B9 Lê Thị Hà My 50 m E; 100 m E; 200 m E XX 10 B10 Phạm Thị Yến 50 m N; 100 m N; 200 m N RX 11 B11 Nguyễn Thị Kiều Oanh 50 m B; 100 m S RR
12 B12 Nguyễn Thị Hiền 50 m S; 100 m S RX
13 B13 Bùi Thị Thùy Dƣơng 50 m E; 100 m E; 200 m E RX
14 B14 Phạm Đắc Thiên 50 m TD; 100 m TD RX
15 B15 Nguyễn Văn Huỳnh 50 m N; 100 m N; 200 m N XX
16 B16 Trần Đức Tài 50 m E; 100 m E RX
17 B17 Trần Văn Triệu 100 m N; 200 m N RX
18 B18 Ngô Thu Hà 100 m B; 100 m S RX
19 B19 Nguyễn Thị Ngọc Yến 100 m N; 200 m N, 50 m TD RX
20 B20 Nguyễn Hữu Việt 50 E; 100E; 200E RX
21 B21 Lê Thị Mỹ Thảo 400 TD; 800 TD; 1500 TD; 50 B XX
22 B22 Nguyễn Thị Diệu Linh 50 TD; 100 TD XX
23 B23 Nguyễn Thị Ngọc Hân 50 E; 100 E; 200 E RR
24 B24 Mai Thị Linh 50 E; 100 E; 200 E RR
25 B25 Nguyễn Thị Trang 50 E; 100 E; 200 E RX 26 B27 Nguyễn ngọc Huynh 50 B; 100 B; 200 B RX
27 B28 Vũ Tấn Thành 50 TD; 100 TD; 200 TD RX
28 B29 Lƣơng Văn Triệu 50 N; 100 N RX
29 B30 Trần Tấn Triệu 400 TD; 800 TD; 1500 TD; RR
30 B31 Nguyễn Hiếu Nghĩa 400 TD; 1500 TD XX
31 B32 Đỗ Văn Hiếu 50 B; 100 B; 200 B RX
32 B33 Bùi Phƣơng Nam 50 N; 100 N; 200 N XX
33 B34 Nguyễn Huy Hoàng 50 N; 100 N; 200 N RR
34 B35 Mai Thị Phƣợng 100 m; 4*100 m RR
Bảng 3. 8. Kết quả xác định kiểu gene ACTN3 R577X của các mẫu đối chứng
STT KH mẫu Họ và tên Giới tính Kiểu gene STT KH mẫu Họ và tên Giới tính Kiểu gene
1 D1 Trần T. Thu Quỳnh Nữ RX 21 D21 Phạm Hoàng Khánh Nam RX 2 D2 Võ Thị Phƣơng Nữ XX 22 D22 Nguyễn Thị Thu Thủy Nữ RR 3 D3 Kiều Trung Kiên Nam RX 23 D23 Phan Quỳnh Lê Nữ XX 4 D4 Nguyễn Khánh Toàn Nam RX 24 D24 Nghiêm T. Hồng Ngát Nữ RR 5 D5 Hà Ngọc Linh Nam XX 25 D25 Nguyễn T. Huyền Trang Nữ RX 6 D6 Trần Kiều Anh Nữ RX 26 D26 Lê Tuấn Anh Nam XX
75 7 D7 Nguyễn Văn Hoàn Nam RX 27 D27 Phạm Thị Ngọc Hà Nữ RR 8 D8 Dƣơng Văn Cƣờng Nam RX 28 D28 Phạm Hồng Quỳnh Anh Nữ XX 9 D9 Ngô Thị Hoa Diệp Nữ XX 29 D29 Nguyễn Huy Bồng Nam RX 10 D10 Quách Thị Trà My Nữ RX 30 D30 Nguyễn Thị Thảo Nữ XX 11 D11 Bùi Thị Năm Nữ RX 31 D31 Trần Thị Tuyết Mai Nữ RX 12 D12 Trần Duy Thanh Nam RX 32 D32 Tạ Phƣơng Đông Nam RR 13 D13 Nguyễn Danh Tuân Nam RX 33 D33 Vũ Anh Công Nam RR 14 D14 Lê Trà My Nữ RR 34 D34 Nguyễn Đình Tuấn Nam RX 15 D15 Đào Hƣơng Ly Nữ RR 35 D35 Ngô Thị Ngọc Nữ RR 16 D16 Nguyễn Thành Luân Nam RR 36 D36 Trần Hồng Hoa Nữ RR 17 D17 Đặng T. Hoài Thanh Nữ RR 37 D37 Phạm Thị Nhàn Nữ RX 18 D18 Nguyễn T. P. Anh Nữ RX 38 D38 Nguyễn Thị Thủy Nữ RX 19 D19 Nguyễn Thị Thắm Nữ XX 39 D39 Trần Thị Huyền Nữ RX 20 D20 Nguyễn Việt Dũng Nam XX 40 D40 Nguyễn Thị Quyên Nữ RX Để kiểm chứng lại điểm đa hình R577X, chúng tôi tiến hành tinh sạch lƣợng lớn sản phẩm PCR và gửi đi phân tích trình tự gene tại công ty McLab (Mỹ). Kết quả thu đƣợc đƣợc minh họa đại diện nhƣ sau (Hình 3. 12; Hình 3. 13
và Hình 3. 14):
Từ kết quả điện di sản phẩm sau khi cắt enzyme cho thấy mẫu B11 cho 2 băng với kích thƣớc là 429 bp và 200 bp. Khi phân tích trình tự của mẫu B11 cho thấy một đỉnh nucleotide C rất rõ ràng (Hình 3. 12). Nhƣ vậy, không có biến dị C→T ở vị trí này. Hai kết quả này hoàn toàn tƣơng đồng nhau. Kiểu gene
ACTN3 tại exon 16 của mẫu B11 đƣợc xác định là RR.
76 Khi đột biến điểm C→T xảy ra ở cả hai bản sao của gene, enzyme DdeI sẽ nhận biết thêm 1 vị trí cắt và cắt đoạn gene tại 2 vị trí nên ta thu đƣợc 3 đoạn DNA có kích thƣớc: 332 bp, 200 bp và 97 bp. Từ kết quả điện di sản phẩm sau khi cắt enzyme (Hình 3. 11) cho thấy mẫu B9 cho 3 băng với kích thƣớc là 332 bp, 200 bp và 97 bp. Khi phân tích trình tự của mẫu B9 cho thấy một đỉnh nucleotide T rất rõ ràng (Hình 3. 13). Nhƣ vậy, biến dị C→T xuất hiện ở cả 2 bản sao. Hai kết quả này hoàn toàn tƣơng đồng nhau. Kiểu gene ACTN3 tại exon 16 của mẫu B9 đƣợc xác định là XX.
Khi đột biến điểm C→T xảy ra ở một trong hai bản sao của gene, enzyme
DdeI sẽ nhận biết thêm 1 vị trí cắt tại bản sao xảy ra đột biến và cắt đoạn gene
tại 2 vị trí nên ta thu đƣợc 4 đoạn DNA có kích thƣớc là 429 bp, 332 bp, 200 bp và 97 bp. Từ kết quả điện di sản phẩm sau khi cắt enzyme cho thấy mẫu K18 cho 4 băng với kích thƣớc tƣơng ứng là 429 bp, 332 bp, 200 bp và 97 bp. Khi phân tích trình tự của mẫu K18 cho thấy một kiểu dị hợp nucleotide C/T rất rõ ràng (Hình 3. 14). Nhƣ vậy, biến dị C→T xuất hiện ở một bản sao (bản sao mang biến dị X). Hai kết quả này hoàn toàn tƣơng đồng nhau. Kiểu gene ACTN3 tại exon 16 của mẫu K18 đƣợc xác định là RX.
Hình 3. 13. Kết quả giải trình tự gene ACTN3 R577X của mẫu B9
77 Nhƣ vậy, bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu với DNA khuôn mẫu đƣợc tách từ niêm mạc miệng của các VĐV, sau đó dùng enzyme giới hạn DdeI để cắt, chúng tôi đã xác định chính xác kiểu gene ACTN3 R577X của mỗi VĐV và các mẫu đối chứng. Các kết quả này đã đƣợc đƣa vào phân tích và kiểm tra bằng phƣơng pháp giải trình tự nhằm khẳng định mức độ chính xác của phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài đã đƣa ra.