Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật phân tích tính đa hình của các đoạn DNA đƣợc cắt bởi các enzyme cắt giới hạn. Kỹ thuật này đã đƣợc sử dụng phổ biến từ thập niên 80, cho đến nay đã có khoảng 3.400 enzyme cắt giới hạn đã đƣợc phát hiện. Trong đó, có khoảng 540 REs đã đƣợc thƣơng mại hóa. Nguyên tắc chung của kỹ thuật này dựa trên khả năng cắt đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên chuỗi DNA. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những đoạn cắt có kích thƣớc khác nhau. Nhờ vào đó ta có thể nhận biết đƣợc sự khác nhau về cấu trúc gene của các loài khác nhau, các cá thể khác nhau trong cùng loài hoặc các bất thƣờng về cấu trúc gene (các đột biến mất, thêm, đảo vị trí hay thay thế 1 hoặc vài cặp nucleotide).
Quy trình kỹ thuật RFLP thông thƣờng bao gồm ba công đoạn chính: (1) tách chiết và tinh sạch DNA, (2) thực hiện phản ứng cắt các mẫu DNA với cùng chủng loại enzyme, (3) điện di và tiến hành phản ứng Southern blot.
Trong thực tế, DNA thể gene của mỗi loài sinh vật đều rất lớn nên khi cắt và thực hiện phản ứng Southern blot sẽ vô cùng phức tạp, tốn kém và mất rất nhiều thời gian phân tích kết quả. Do đó, trong hầu hết các nghiên cứu, chỉ một vài trình tự gene mục tiêu đƣợc lựa chọn để nghiên cứu. Hiện nay, kỹ thuật RFLP-PCR đƣợc sử dụng nhiều hơn so với kỹ thuật RFLP đơn thuần, đó là kỹ thuật dựa trên sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR và kỹ thuật RFLP truyền thống.
Quy trình kỹ thuật RFLP-PCR bao gồm các bƣớc: (1) tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, (2) thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự gene mục tiêu, (3) tinh sạch sản phẩm PCR và thực hiện phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn, (4) điện di sản phẩm cắt và phân tích kết quả.
Phƣơng pháp RFLP-PCR có những ƣu điểm vƣợt trội so với kỹ thuật RFLP truyền thống nhƣ: (1) có độ nhạy cao vì chỉ cẩn một lƣợng nhỏ DNA khuôn đã có thể thu đƣợc lƣợng DNA cần thiết cho phản ứng cắt; (2) đơn giản, dễ thực hiện và có thể quan sát kết quả ngay sau khi điện di trên gel Agarose; (3) chi phí thấp vì không cần sử dụng mẫu dò để kiểm tra sản phẩm cắt; (4) an toàn do không phải đánh dấu bằng các hợp chất huỳnh quang hoặc chỉ thị phóng xạ.
39
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU