2.1.1. Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu trong thí nghiệm là các mẫu tế bào niêm mạc miệng và mẫu máu khô trên thẻ FTA của các VĐV điền kinh và bơi lội thuộc đội tuyển quốc gia và đội tuyển trẻ đang tập trung tập luyện tại ba Trung tâm Huấn luyện thể thao Quốc gia Hà Nội, Đà Nẵng và TP. Hồ Chí Minh. Danh sách các VĐV bao gồm:
54 VĐV điền kinh tham gia các nội dung thi đấu gồm: chạy cự ly ngắn, trung bình, dài; nhảy 3 bƣớc; chạy vƣợt rào... Các mẫu VĐV điền kinh đƣợc ký hiệu từ K1 đến K54.
34 VĐV bơi lội tham gia các nội dung thi đấu bao gồm: bơi ngắn, trung bình và dài. Các mẫu VĐV bơi lội đƣợc kí hiệu từ B1 đến B34.
Ngoài ra, 40 sinh viên tình nguyện đến từ trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, cũng đƣợc thu mẫu để làm mẫu đối chứng. Các mẫu đối chứng này đƣợc kí hiệu từ D1 đến D40.
Tất cả các đối tƣợng tham gia cung cấp mẫu thí nghiệm đều là tự nguyện. Các đối tƣợng nghiên cứu này cũng đã đƣợc xác định là không có quan hệ huyết thống với nhau. Thành tích thể thao; dân tộc, giới tính ... cũng đƣợc thu thập để phục vụ cho mục đích nghiên cứu.
Thời gian thu mẫu: từ tháng 2 năm 2013 đến tháng 6 năm 2013.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
* Dụng cụ:
Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất, đầu lọc hóa chất, hộp đựng đá....
* Thiết bị:
Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: bốc cấy vô trùng (Yamato, Nhật Bản); cân phân tích (Mettler Toledo – Thụy Điển); cân kỹ thuật (Satorius – Đức); lò vi sóng (Sharp – Malaysia); máy PCR (GeneAmp PCR
40 system 9700 – Mỹ); Máy giải trình từ ABI 3130 (Mỹ); máy soi gel (Stage - 1000, AMZ); nồi khử trùng (Đài Loan); máy điện di (GelMate 2000 – Nhật Bản); tủ lạnh sâu (Sanyo – Nhật Bản); tủ ấm, tủ sấy (Jeio Tech – Hàn Quốc); bể ổn nhiệt (Thermal Robo TR-2A); máy quang phổ Quawell Q3000 (Quawell, Mỹ)....
2.1.3. Sinh phẩm, hóa chất tiêu hao
* Sinh phẩm:
- Kit tách chiết DNA từ tế bào niêm mạc miệng (Buccal Swab DNA Extraction Kit), kit tinh sạch sản phẩm PCR (PCR and DNA fragament purification Kit) của hãng GeneShun Biotech (Trung Quốc).
- Kit dùng trong phản ứng PCR (Go-Taq Green PCR mix) (Promega, Mỹ). - Bộ kit cắt enzyme giới hạn DdeI (BioLabs, Mỹ).
* Hóa chất:
- Đệm TAE 50X (242 g Tris – Base; 57,1 mL CH3COOH; 100 mL 0,5M EDTA; H2O vừa đủ 1000 mL, pH = 8,5)
- Dung dịch nhuộm gel (0,1µg/mL ethidium bromide )
- Loading dye (0,03% brommophenol blue; 100 mM Tris-HCl (pH 7.6); 60% Glycerol, 60 mM EDTA)
- 100 bp Ladder Plus (17 µg/µL) - Agarose Metaphore (Lonza, Mỹ)
- Các hóa chất và dung dịch dùng trong các thí nghiệm sinh học phân tử khác.
* Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gene ACE I/D:
Để khuếch đại gene ACE I/D, chúng tôi đã khảo sát các trình tự của gene này đƣợc công bố trên ngân hàng gene quốc tế, phân tích các đặc điểm của gene cũng nhƣ tham khảo các bài báo liên quan đã đƣợc công bố trƣớc đó và thiết kế các cặp mồi có độ dài và trình tự nhƣ sau (Bảng 2.1):
Bảng 2. 1. Các cặp mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại gene ACE I/D
Tên mồi Mồi 5’-3’ Độ dài mồi (bp)
ACE-F ACT CTG TAA GCC ACT GCT GGA GA 23
ACE-R1 CAG CCT GGT TGA TGA GTT CCA C 22
41
* Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gene ACTN3 R577X:
- Để khuếch đại gene ACTN3 R577X, chúng tôi đã khảo sát các trình tự của gene này đƣợc công bố trên ngân hàng gene quốc tế và thiết kế các cặp mồi có độ dài và trình tự nhƣ sau (Bảng 2.2):
Bảng 2. 2. Các cặp mồi đƣợc thiết kế để khuếch đại gene ACTN3 R577X
Tên mồi Trình tự mồi (5’→3’) Độ dài mồi (bp)
1ACTN3 –F CTG TTG CCT GTG GTA AGT GGG 21
2ACTN3 –F ACT CTG TGG AGG AGA CCC AG 20
1ACTN3 –R TGG TCA CAG TAT GCA GGA GGG 21
2ACTN3 –R TGA GCC CGA GACA GGC AAG 19
3ACTN3 –F CAC TGC CCG AGG CTG ACC 18
2.2. Quy trình nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu đƣợc tiến hành theo sơ đồ sau: Thu mẫu tế bào niêm mạc miệng/mẫu
máu trên thẻ FTA
Tách chiết DNA
Khuếch đại gene ACE với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế
Khuếch đại gene ACTN3 với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế
Tinh sạch sản phẩm PCR Cắt bằng enzyme cắt giới hạn DdeI
Điện di trên gel agarose
Xác định đa hình gene, lập bảng số liệu thống kê và phân tích tần số Giải trình tự
gene để kiểm tra
Gene ACE Gene ACTN3
42
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu tế bào niêm mạc miệng
Mỗi đối tƣợng tham gia nghiên cứu đƣợc thu mẫu tế bào niêm mạc miệng bằng cách sử dụng 4 que tăm bông thu mẫu chuyên dụng. Quy trình thu mẫu đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau:
- Bƣớc 1: Chuẩn bị bộ kit thu mẫu tế bào niêm mạc miệng. Điền đầy đủ thông tin của ngƣời thu mẫu vào phong bì đựng mẫu.
- Bƣớc 2: Súc miệng trong 10 giây với nƣớc ấm.
- Bƣớc 3: Lấy cây tăm bông trong bộ kit (không đƣợc cầm vào đầu tăm bông).
- Bƣớc 4: Đƣa đầu tăm bông vào thành má trong (bên trong vòm miệng), dùng đầu tăm bông quẹt xoay tròn vào bên thành má trong khoảng 10 - 20 giây, (chú ý: ấn nhẹ đầu tăm bông vào thành má trong), nhƣ vậy sẽ thu đƣợc 1 que. Lặp lại thao tác trên 4 lần, mỗi bên má 2 que, nhƣ vậy sẽ thu đƣợc tổng là 4 que. - Bƣớc 5: Cho ngay que bông tăm đã có mẫu (tổng là 4 que cho mỗi ngƣời) vào phong bì đựng mẫu đã ghi sẵn tên và ký hiệu của từng ngƣời.
- Bƣớc 6: Bỏ phong bì đựng mẫu vào túi zipcode bảo quản mẫu. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ 4º
C.
2.3.2. Phƣơng pháp thu mẫu tế máu khô trên thẻ FTA
Quy trình thu mẫu máu khô trên thẻ FTA đƣợc tiến hành nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Chuẩn bị thẻ FTA. Điền đầy đủ thông tin của ngƣời thu mẫu vào phần điền thông tin trên thẻ thu mẫu và phong bì đựng mẫu.
- Bƣớc 2: Khử trùng đầu ngón tay định trích máu bằng miếng gạc đã tầm cồn khử trùng. Dùng lancet tiệt trùng chích máu ở đầu ngón tay. Nhỏ máu vào giữa vòng tròn thu mẫu. Dùng gạc vô trùng để lau/giữ vết trích.
- Bƣớc 3: Để khô mẫu tự nhiên ở nhiệt độ phòng
- Bƣớc 4: Cho mẫu vào phong bì đựng mẫu đã ghi sẵn tên và ký hiệu của từng ngƣời. Chú ý nên làm hoàn tất từng ngƣời một, tránh nhầm mẫu. Ghi chép cẩn thận, chính xác.
43 - Bƣớc 5: Bỏ phong bì đựng mẫu và gói hút ẩm vào túi zipcode bảo quản mẫu. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng hoặc trong tủ 4º
C.
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA
Với mục đích sử dụng DNA để làm khuôn cho các phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng và mẫu máu khô trên thẻ FTA của các mẫu nghiên cứu theo quy trình tách chiết của bộ kit Buccal Swab DNA Extraction Kit (Cat#GS3062) của hãng GeneShun Biotech (Trung Quốc).
* Nguyên tắc chung:
Sử dụng lysis buffer/Protease K để phân giải nhanh tế bào và bất hoạt enzyme nuclease của tế bào, sau đó DNA hấp thụ chọn lọc lên màng silica trong dung dịch có nồng độ muối cao. Các thành phần không mong muốn của tế bào và protein đƣợc loại bỏ bằng nhiều bƣớc rửa và li tâm loại bỏ dịch cặn. Cuối cùng, thu hồi DNA từ màng silica bằng cách bổ sung dung dịch có nồng độ muối thấp. Trong phƣơng pháp này, chúng tôi có sử dụng bổ sung Carrier RNA vào quy trình tách chiết nhằm mục đích gia tăng hiệu quả tách chiết DNA.
* Quy trình tách chiết DNA từ mẫu tế bào niêm mạc miệng:
1. Cắt lấy đầu tăm bông, cho vào ống li tâm 2 mL và thêm 400 µL đệm ML.
2. Bổ sung 20 µL protase K (20 mg/mL), vortex trong 10 giây để trộn đều. Ủ ở 56ºC trong 60 phút, cứ 10 phút đảo đều 1 lần trong khi ủ.
3. Thêm 400 µL đệm liên kết CB, vortex để trộn đều. Ủ ở 70ºC trong 10 phút.
4. Sau khi để mát về nhiệt độ phòng, thêm 200 µL ethanol 100% và trộn đều, li tâm ngắn (5100 rpm trong 1 phút) để thu lại lƣợng dung dịch còn đọng trên lắp. Nếu nhiệt độ xung quanh trên 25º
C, ethanol nên đƣợc làm lạnh trƣớc. 5. Chuyển 800 µL hỗn hợp sang Spin-column AC (cột nằm trong ống thu mẫu), li tâm 13.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch lọc.
44 7. Thêm 500 µL đệm WB li tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 8. Thêm 500 µL đệm WB và li tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 9. Để Spin-column AC trở lại ống thu mẫu và ly tâm ở 12.000 rpm trong 4 phút. 10. Chuyển Spin-column AC sang ống eppendorf mới và thêm 30 µL đệm EB đã ủ ấm ở 65 – 70ºC vào giữa tâm của cột spin-column AC. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Li tâm ở 12.000 rpm trong 2 phút. Thu dịch chứa DNA tổng số.
11. Bảo quản ở 2 – 8º
C (-20ºC khi bảo quản dài hạn).
* Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu khô trên thẻ FTA
1. Cắt một vòng tròn máu (đƣờng kính khoảng 0,5 cm) cho vào ống li tâm 2mL và thêm 400 µL đệm ML.
2. Bổ sung 20 µL protase K (20 mg/mL), vortex trong 10s để trộn đều. Ủ ở 56ºC trong 60 phút, cứ 10 phút đảo đều 1 lần trong khi ủ.
3. Thêm 400 µL đệm liên kết CB và 1µL dung dịch Carrier RNA, vortex để trộn đều. Ủ ở 700 º
C trong 10 phút.
4. Sau khi để mát về nhiệt độ phòng, thêm 100 µL ethanol 100% và trộn đều, li tâm ngắn (5.100 rpm trong 1 phút) để thu lại lƣợng dung dịch còn đọng trên lắp. Nếu nhiệt độ xung quanh trên 25ºC, ethanol nên đƣợc làm lạnh trƣớc.
5. Chuyển 800 µL hỗn hợp sang Spin-column AC (cột nằm trong ống thu mẫu), ly tâm 13.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch lọc.
6. Thêm 500 µLđệm IR và ly tâm ở 12.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch lọc. 7. Thêm 500 µL đệm WB ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 8. Thêm 500 µL đệm WB và ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 9. Để Spin-column AC trở lại ống thu mẫu và li tâm ở 12.000 rpm trong 4 phút. 10. Chuyển Spin-column AC sang ống eppendorf mới và thêm 30 µl đệm EB đã ủ ấm ở 65 – 70ºC vào giữa tâm của cột spin-column AC. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Li tâm ở 12.000 rpm trong 2 phút. Thu dịch chứa DNA tổng số.
11. Bảo quản ở 2 – 8º
45
2.3.4. Phƣơng pháp PCR
* Khuếch đại vùng intron 16 của gene ACE I/D bằng kỹ thuật PCR
Để khuếch đại vùng intron 16 của gene ACE, dựa trên phân tích và nghiên cứu lý thuyết, chúng tôi đã xây dựng một quy trình PCR với các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cơ bản nhƣ đƣợc trình bày tại Bảng 2.3 và 2.4. Dựa trên quy trình PCR cơ bản này, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sẽ tiến hành điều chỉnh các thành phần và điều kiện để xác định quy trình tối ƣu nhất đối với các yêu cầu của đề tài.
Bảng 2. 3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACE I/D
Thành phần Nồng độ cuối cùng
Go-Taq Green master mix 1X
2ACTN3 - F 2 pmol/µL
2ACTN3 - R 2 pmol/µL
DNA khuôn (10ng/ul) <50 ng
H2O Vừa đủ thể tích yêu cầu
Trong đó Go-Taq Green master mix, 2X (Promega, Mỹ) bao gồm: 0,05 U/µl Taq DNA Polymerase; 2X Green GoTaq buffer (pH 8,5); 3 mM MgCl2 và 400 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.4:
Bảng 2. 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ACE I/D
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 95ºC 5 phút Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
Tách DNA khuôn 95ºC 60 giây Ủ bắt cặp mồi 60ºC 90 giây
Kéo dài 72ºC 45 giây
Giai đoạn kết thúc 72ºC 10 phút
46
* Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR
Trên cơ sở đánh giá và nghiên cứu các thông số lý thuyết; phân tích các đặc tính của các cặp mồi đã thiết kế; cũng nhƣ dựa vào khuyến cáo của các hãng cung cấp kit và hóa chất cho thí nghiệm, chúng tôi đã xây dựng quy trình thực hiện phản ứng PCR với các thành phần phản ứng và quy trình nhiệt nhƣ đƣợc trình bày tại Bảng 2.5 và 2.6. Theo thành phần phản ứng và quy trình nhiệt này, trong quá trình thực hiện các thí nghiệm, chúng tôi sẽ điều chỉnh nồng độ và điều kiện để tối ƣu hóa phản ứng PCR, sao cho kết quả của phản ứng khuếch đại gene sẽ đáp ứng đƣợc tốt nhất các yêu cầu mà giai đoạn này cần đạt, bao gồm: sản phẩm khuếch đại phải đặc hiệu, độ nhạy cao, các băng DNA có thể phân biệt đƣợc rõ ràng qua điện di trên gel agarose.
Bảng 2. 5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X
Thành phần Nồng độ cuối cùng
Go-Taq Green master mix 1X
2ACTN3 - F 2 pmol/µL
2ACTN3 - R 2 pmol/µL
DNA khuôn (10ng/ul) <50 ng
H2O Vừa đủ thể tích yêu cầu
Trong đó Go-Taq Green master mix, 2X (Promega, Mỹ) bao gồm: 0,05 U/µL Taq DNA Polymerase; 2X Green GoTaq buffer (pH 8,5); 3 mM MgCl2 và 400 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.6:
Bảng 2. 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 95 ºC 5 phút Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
Tách DNA khuôn 95 ºC 60 giây Ủ bắt cặp mồi 62 ºC 90 giây Kéo dài 72 ºC 45 giây Giai đoạn kết thúc 72 ºC 10 phút
47
2.3.5. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR * Nguyên lý * Nguyên lý
Thông thƣờng sản phẩm PCR thƣờng bị lẫn tạp bởi muối và một lƣợng nhỏ mồi, dNTPs, DNA polymerase không sử dụng hết. Do đó, chúng có ảnh hƣởng nhất định tới chất lƣợng sản phẩm. Để loại những tạp chất, chúng tôi đã sử dụng kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Geneshun Biotech.
* Quy trình thực hiện
1. Thêm 3 lần thể tích đệm BD vào mẫu, trộn đều.
2. Chuyển toàn bộ dung dịch trên sang ống DNA spin column trong ống thu 2 mL sạch → ủ trong 2 phút → li tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ phần dịch.
3. Thêm 500 µL đệm rửa PE → li tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút ở điều kiện phòng để rửa mẫu → bỏ phần dịch chảy qua.
4. Lặp lại bƣớc 3 một lần nữa để rửa sạch sản phẩm PCR
5. Li tâm tiếp cột lọc 12.000 rpm trong 2 phút để làm khô cột. Đây là bƣớc rất quan trọng để loại bỏ hoàn toàn ethanol khỏi cột.
6. Chuyển cột vào ống li tâm 1,5 mL sạch → Thêm 30 - 50 µL đệm EB hoặc nƣớc deion đã tiệt trùng (phụ thuộc vào nồng độ yêu cầu của sản phẩm cuối cùng) trực tiếp vào phần trung tâm của màng lọc → ủ 5 phút → li tâm 12.000 rpm trong 2 phút để thu hồi DNA đã tinh sạch.
2.3.6. Phƣơng pháp RFLP-PCR
* Nguyên lý và phân tích điểm cắt enzyme
Enzyme giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết và cắt một đoạn trình tự đặc hiệu có độ dài khoảng 4 đến 7 cặp nucleotide trên mạch DNA mạch kép thành các đoạn DNA nhỏ có dạng đầu dính hoặc đầu bằng. Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong nghiên cứu này là để nhận biết kiểu gene
ACTN3 R577X thông qua các điểm cắt và sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme
48 Actctgtggaggagacccaggtgggtgccagggttgcaggggatggataggatgacaggaaagctggccccaaattctgccaccca caactttaggctcctggggcatagggatgggaggaaaaccccagttcccgagtgcgggctggaagacaggaggccggggttcttgtgt caggactgcccaggactggtgggtggcctggggcacactgctgccctttctgttgcctgtggtaagtgggggacaccagctgacacttcc tgcctgtcgtccccagagcctgctgacagcgcacgatcagttcaaggcaacactgcccgaggctgacC/Taggagcgaggtgccatc atgggcatccagggtgagatccagaagatctgccagacgtatgggctgcggccctgctccaccaatccctacatcacccTcagcccgc aggagcatcaacaccaagtgggatatggtcagtgccacctgcagccttcctcccaccccctcctgcatactgtgaccaccctgaaatctcg ggtggcccaagatatggagaataaagtccatcttcagatgtggggtctgccacagactccacgtgggattggataaatcgccttgcctgtc tcgggctca
Hình 2. 2. Vị trí các điểm cắt của enzyme DdeI trên trình tự gene ACTN3
Trong đoạn gene exon 16 ACTN3 này có 1 hoặc 2 điểm cắt của enzyme DdeI, tùy thuộc vào kiểu gene của từng ngƣời (Hình 2.1 và 2.2). Vì vậy, khi sử
dụng enzyme này để cắt sản phẩm PCR gene ACTN3 thì xảy ra các trƣờng hợp