Để kiểm tra lại kết quả của phản ứng PCR khuếch đại gene ACE và xác định đa hình I/D của gene này, chúng tôi đã tiến hành thôi gel và giải trình tự trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3130 của hãng Life Technologies (Mỹ).
Thay vì tập trung giải trình tự toàn bộ vùng gene đã khuếch đại, chúng tôi sẽ xem xét và tìm kiếm đoạn trình tự riêng biệt chỉ có ở từng alen (Hình 3. 4).
* Giải trình tự mẫu có kiểu gene ID: Mẫu B9, của VĐV Lê Thị Trà My là
mẫu mà chúng tôi đã lựa chọn tiêu biểu cho kiểu gene ID. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành điện di lại mẫu này với lƣợng sản phẩm PCR lớn hơn, và đảm bảo điều kiện điện di đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt về độ tinh sạch. Sau đó, tiến hành cắt riêng 2 băng điện di tƣơng ứng với vị trí của alen I và alen D trên bản điện di. Các băng điện di này sẽ đƣợc thực hiện thôi gel bằng bộ Kit thôi gel của hãng Geneshun Biotech. DNA thu đƣợc sẽ đƣợc mang đi giải trình tự. Kết quả đọc trình tự alen D và alen I của mẫu B9 thu đƣợc nhƣ sau (Hình 3. 5).
59
Hình 3. 4. Trình tự alen I và alen D của gene ACE
V1: Vùng trình tự chỉ có ở alen I; V2: vùng trình tự chỉ có ở alen D
Theo quan sát trên Hình 3. 5 cho thấy, ở kết quả giải trình tự của alen I, có sự xuất hiện của đoạn trình tự V1 (đoạn trình tự sắp xếp đặc trƣng chỉ có ở alen
Alen I
Alen D V2
V1
Hình 3. 5. Kết quả giải trình tự alen I và alen D của mẫu B9
Alen I ACTCTGTAAGCCACTGCTGGAGACCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTCTCTAGAC CTGCTGCCTATACAGTCACTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTCTGTC GCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGGGATCTCGGCTCACTGCAACGTCCGCCTCC CGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCACAGCGC CCGCCACTACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACC GTTTTAGCCGGGATGGTCTCGATCTCCTGACCTCGTGATCCGCCCGCCTCGGCC TCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGATACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCC AATTTTATTCCAGCTCTGAAATTCTCTGAGCTCCCCTTACAAGCAGAGGTGAGC TAAGGGCTGGAGCTCAAGCCATTCAACCCCCTACCAGATCTGACGAATGTGAT GGCCACGTCCCGGAAATATGAAGACCTGTTATGGGC V1 Alen D ACTCTGTAAGCCACTGCTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTCTCTAG ACCTGCTGCCTATACAGTCACTTTTATGTGGTTTCGCCAATTTTATTCCAGCTCT GAAATTCTCTGAGCTCCCCTTACAAGCAGAGGTGAGCTAAGGGCTGGAGCTCA AGGCATTCAAACCCCTACCAGATCTGACGAATGTGATGGCCACGTCCCGGAAA TATGAAGACCTGTTATGGGC V2
60 I) và kết quả giải trình tự của alen D, có sự xuất hiện của đoạn trình tự V2 (đoạn trình tự đặc trƣng chỉ có ở alen D). Nhƣ vậy, có thể nói rằng kết quả kiểm chứng bằng phƣơng pháp thôi gel giải trình tự hoàn toàn tƣơng đồng với kết quả xác định kiểu gene thông qua điện di sản phẩm PCR.
* Giải trình tự mẫu có kiểu gene II: mẫu B1, VĐV Hoàng Quý Phƣớc là
mẫu có kiểu gene II mà chúng tôi đã lựa chọn để giải trình tự. Do đây là mẫu có kiểu gene đồng hợp, nên chúng tôi không tiến hành thôi gel mà thực hiện giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR tinh sạch. Hình 3. 6 là kết quả giải trình tự gene của mẫu B1 mà chúng tôi đã thu đƣợc.
Hình 3. 6. Kết quả giải trình tự gene ACE mẫu B1
Trên kết quả giải trình tự này, chúng tôi tìm thấy vùng trình tự V1, đây là vùng trình tự đặc trƣng của alen I. Hình ảnh thu đƣợc rõ ràng, không bị nhiễu. Cho thấy kết luận đây là mẫu có kiểu gene II là kết luận chính xác.
* Giải trình tự mẫu có kiểu gene DD: mẫu K12, VĐV Nguyễn Thành
Ngƣng là mẫu có kiểu gene DD mà chúng tôi đã lựa chọn để giải trình tự. Cũng tƣơng tự nhƣ mẫu B1, do đây là mẫu có kiểu gene đồng hợp, nên chúng tôi không tiến hành thôi gel mà thực hiện giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR tinh sạch. Hình 3. 7 là kết quả giải trình tự gene của mẫu K12 mà chúng tôi đã thu đƣợc.
61
Hình 3. 7. Kết quả giải trình tự gene ACE của mẫu K12
Tƣơng tự nhƣ 2 mẫu trên, chúng tôi cũng đã tìm thấy vùng trình tự V2, là vùng trình tự đặc trƣng cho alen D, và hình ảnh đoạn trình tự thu đƣợc cũng không bị nhiễu. Điều đó cho thấy chỉ có duy nhất 1 kiểu alen D trong mẫu K12. Nhƣ vậy, kết luận mẫu D12 là mẫu có kiểu gene DD là một kết luận chính xác.