* Khuếch đại vùng intron 16 của gene ACE I/D bằng kỹ thuật PCR
Để khuếch đại vùng intron 16 của gene ACE, dựa trên phân tích và nghiên cứu lý thuyết, chúng tôi đã xây dựng một quy trình PCR với các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cơ bản nhƣ đƣợc trình bày tại Bảng 2.3 và 2.4. Dựa trên quy trình PCR cơ bản này, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sẽ tiến hành điều chỉnh các thành phần và điều kiện để xác định quy trình tối ƣu nhất đối với các yêu cầu của đề tài.
Bảng 2. 3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACE I/D
Thành phần Nồng độ cuối cùng
Go-Taq Green master mix 1X
2ACTN3 - F 2 pmol/µL
2ACTN3 - R 2 pmol/µL
DNA khuôn (10ng/ul) <50 ng
H2O Vừa đủ thể tích yêu cầu
Trong đó Go-Taq Green master mix, 2X (Promega, Mỹ) bao gồm: 0,05 U/µl Taq DNA Polymerase; 2X Green GoTaq buffer (pH 8,5); 3 mM MgCl2 và 400 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.4:
Bảng 2. 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ACE I/D
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 95ºC 5 phút Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
Tách DNA khuôn 95ºC 60 giây Ủ bắt cặp mồi 60ºC 90 giây
Kéo dài 72ºC 45 giây
Giai đoạn kết thúc 72ºC 10 phút
46
* Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR
Trên cơ sở đánh giá và nghiên cứu các thông số lý thuyết; phân tích các đặc tính của các cặp mồi đã thiết kế; cũng nhƣ dựa vào khuyến cáo của các hãng cung cấp kit và hóa chất cho thí nghiệm, chúng tôi đã xây dựng quy trình thực hiện phản ứng PCR với các thành phần phản ứng và quy trình nhiệt nhƣ đƣợc trình bày tại Bảng 2.5 và 2.6. Theo thành phần phản ứng và quy trình nhiệt này, trong quá trình thực hiện các thí nghiệm, chúng tôi sẽ điều chỉnh nồng độ và điều kiện để tối ƣu hóa phản ứng PCR, sao cho kết quả của phản ứng khuếch đại gene sẽ đáp ứng đƣợc tốt nhất các yêu cầu mà giai đoạn này cần đạt, bao gồm: sản phẩm khuếch đại phải đặc hiệu, độ nhạy cao, các băng DNA có thể phân biệt đƣợc rõ ràng qua điện di trên gel agarose.
Bảng 2. 5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X
Thành phần Nồng độ cuối cùng
Go-Taq Green master mix 1X
2ACTN3 - F 2 pmol/µL
2ACTN3 - R 2 pmol/µL
DNA khuôn (10ng/ul) <50 ng
H2O Vừa đủ thể tích yêu cầu
Trong đó Go-Taq Green master mix, 2X (Promega, Mỹ) bao gồm: 0,05 U/µL Taq DNA Polymerase; 2X Green GoTaq buffer (pH 8,5); 3 mM MgCl2 và 400 µM dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.6:
Bảng 2. 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X
Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian
Giai đoạn khởi động 95 ºC 5 phút Chạy chu kỳ (35 chu kỳ)
Tách DNA khuôn 95 ºC 60 giây Ủ bắt cặp mồi 62 ºC 90 giây Kéo dài 72 ºC 45 giây Giai đoạn kết thúc 72 ºC 10 phút
47