Kary Mullis là ngƣời đầu tiên phát minh ra kỹ thuật PCR và kỹ thuật này đã đƣợc công bố lần đầu tiên vào năm 1985. Chỉ sau một thời gian rất ngắn PCR đã trở thành một kỹ thuật phổ biến, đƣợc áp dụng rộng rãi trong cả nghiên cứu và xét nghiệm lâm sàng nhƣ: chuẩn đoán bệnh, phát hiện những mầm bệnh có trong thực phẩm, đồ uống và nhiều ứng dụng khác. Ngày nay, kỹ thuật PCR đƣợc xem nhƣ một kỹ thuật kinh điển và đƣợc ứng dụng trong hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử vì nó độ nhạy cao, đơn giản và khả năng ứng dụng rộng rãi.
Với kỹ thuật PCR, trình tự DNA mục tiêu sẽ đƣợc khuếch theo cấp số nhân nhờ sự xúc tác của enzyme DNA polymerase và máy chu trình nhiệt. Một phản ứng PCR thông thƣờng bao gồm một cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, dNTPs, DNA khuôn và dung dịch đệm.
Mồi dùng trong phản ứng PCR là những đoạn DNA ngắn (thƣờng dài 18-25 nucleotide) đƣợc thiết kế dựa trên trình tự DNA mục tiêu (mạch khuôn). Cặp mồi PCR phải đƣợc thiết kế sao cho có khả năng bắt cặp đặc hiệu tại 2 đầu trình tự DNA mục tiêu và chỉ khuếch đại duy nhất đoạn DNA đó mà không phải bất cứ đoạn DNA nào khác.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo một chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn: biến tính, bắt cặp, kéo dài và hoàn thiện sản phẩm (Hình 1.10).
- Giai đoạn biến tính DNA: thƣờng đƣợc thực hiện tại 94oC, trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 2 phút, tùy thuộc vào kích thƣớc sản phẩm PCR. Dƣới tác động của nhiệt, DNA mạch kép bị tách thành các sợi DNA đơn, tạo thành các khuôn cho mồi tới bắt cặp.
- Giai đoạn bắt cặp giữa mồi và DNA khuôn: đây là giai đoạn rất quan
trọng, nó là một trong những yếu tố ảnh hƣởng tới số lƣợng và chất lƣợng sản phẩm PCR, nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào kích thƣớc của cặp mồi cũng nhƣ đặc
37 tính cấu trúc của cặp mồi (tỷ lệ GC, các chỉ số dimer, self-dimer, cấu trúc kẹp tóc...). Nhiệt độ bắt cặp thƣờng dao động trong khoảng từ 55 – 65o
C, trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 2 phút.
- Giai đoạn tổng hợp chuỗi DNA (kéo dài): thƣờng đƣợc thực hiện ở nhiệt
độ 72oC để đảm bảo cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất, với hiệu suất và tính chính xác cao nhất, thời gian kéo dài sản phẩm cũng tùy thuộc vào kích thƣớc của sản phẩm và thƣờng dao động trong khoảng 1 – 3 phút.
- Giai đoạn hoàn thiện sản phẩm: thƣờng đƣợc thực hiện trong khoảng từ 5
– 10 phút tại 72o C.
Toàn bộ quá trình trên đƣợc thực hiện lặp lại (trừ giai đoạn hoàn thiện sản phẩm) từ 25 tới 40 chu kỳ trong vòng 2 – 4 giờ, kết quả là ta có thể thu đƣợc hàng tỷ bản sao từ một lƣợng nhỏ DNA khuôn ban đầu. Do đó, PCR là một kỹ thuật khuếch đại DNA trong điều kiện in vitro có hiệu suất và độ đặc hiệu cao, có độ nhạy vƣợt trội, cho kết quả nhanh chóng, tính tự động hóa và có khả năng ứng dụng cao.
38