Với mục đích sử dụng DNA để làm khuôn cho các phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng và mẫu máu khô trên thẻ FTA của các mẫu nghiên cứu theo quy trình tách chiết của bộ kit Buccal Swab DNA Extraction Kit (Cat#GS3062) của hãng GeneShun Biotech (Trung Quốc).
* Nguyên tắc chung:
Sử dụng lysis buffer/Protease K để phân giải nhanh tế bào và bất hoạt enzyme nuclease của tế bào, sau đó DNA hấp thụ chọn lọc lên màng silica trong dung dịch có nồng độ muối cao. Các thành phần không mong muốn của tế bào và protein đƣợc loại bỏ bằng nhiều bƣớc rửa và li tâm loại bỏ dịch cặn. Cuối cùng, thu hồi DNA từ màng silica bằng cách bổ sung dung dịch có nồng độ muối thấp. Trong phƣơng pháp này, chúng tôi có sử dụng bổ sung Carrier RNA vào quy trình tách chiết nhằm mục đích gia tăng hiệu quả tách chiết DNA.
* Quy trình tách chiết DNA từ mẫu tế bào niêm mạc miệng:
1. Cắt lấy đầu tăm bông, cho vào ống li tâm 2 mL và thêm 400 µL đệm ML.
2. Bổ sung 20 µL protase K (20 mg/mL), vortex trong 10 giây để trộn đều. Ủ ở 56ºC trong 60 phút, cứ 10 phút đảo đều 1 lần trong khi ủ.
3. Thêm 400 µL đệm liên kết CB, vortex để trộn đều. Ủ ở 70ºC trong 10 phút.
4. Sau khi để mát về nhiệt độ phòng, thêm 200 µL ethanol 100% và trộn đều, li tâm ngắn (5100 rpm trong 1 phút) để thu lại lƣợng dung dịch còn đọng trên lắp. Nếu nhiệt độ xung quanh trên 25º
C, ethanol nên đƣợc làm lạnh trƣớc. 5. Chuyển 800 µL hỗn hợp sang Spin-column AC (cột nằm trong ống thu mẫu), li tâm 13.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch lọc.
44 7. Thêm 500 µL đệm WB li tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 8. Thêm 500 µL đệm WB và li tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 9. Để Spin-column AC trở lại ống thu mẫu và ly tâm ở 12.000 rpm trong 4 phút. 10. Chuyển Spin-column AC sang ống eppendorf mới và thêm 30 µL đệm EB đã ủ ấm ở 65 – 70ºC vào giữa tâm của cột spin-column AC. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Li tâm ở 12.000 rpm trong 2 phút. Thu dịch chứa DNA tổng số.
11. Bảo quản ở 2 – 8º
C (-20ºC khi bảo quản dài hạn).
* Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu khô trên thẻ FTA
1. Cắt một vòng tròn máu (đƣờng kính khoảng 0,5 cm) cho vào ống li tâm 2mL và thêm 400 µL đệm ML.
2. Bổ sung 20 µL protase K (20 mg/mL), vortex trong 10s để trộn đều. Ủ ở 56ºC trong 60 phút, cứ 10 phút đảo đều 1 lần trong khi ủ.
3. Thêm 400 µL đệm liên kết CB và 1µL dung dịch Carrier RNA, vortex để trộn đều. Ủ ở 700 º
C trong 10 phút.
4. Sau khi để mát về nhiệt độ phòng, thêm 100 µL ethanol 100% và trộn đều, li tâm ngắn (5.100 rpm trong 1 phút) để thu lại lƣợng dung dịch còn đọng trên lắp. Nếu nhiệt độ xung quanh trên 25ºC, ethanol nên đƣợc làm lạnh trƣớc.
5. Chuyển 800 µL hỗn hợp sang Spin-column AC (cột nằm trong ống thu mẫu), ly tâm 13.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch lọc.
6. Thêm 500 µLđệm IR và ly tâm ở 12.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch lọc. 7. Thêm 500 µL đệm WB ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 8. Thêm 500 µL đệm WB và ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc. 9. Để Spin-column AC trở lại ống thu mẫu và li tâm ở 12.000 rpm trong 4 phút. 10. Chuyển Spin-column AC sang ống eppendorf mới và thêm 30 µl đệm EB đã ủ ấm ở 65 – 70ºC vào giữa tâm của cột spin-column AC. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Li tâm ở 12.000 rpm trong 2 phút. Thu dịch chứa DNA tổng số.
11. Bảo quản ở 2 – 8º
45