* Nguyên lý và phân tích điểm cắt enzyme
Enzyme giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết và cắt một đoạn trình tự đặc hiệu có độ dài khoảng 4 đến 7 cặp nucleotide trên mạch DNA mạch kép thành các đoạn DNA nhỏ có dạng đầu dính hoặc đầu bằng. Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong nghiên cứu này là để nhận biết kiểu gene
ACTN3 R577X thông qua các điểm cắt và sản phẩm sau khi cắt bằng enzyme
48 Actctgtggaggagacccaggtgggtgccagggttgcaggggatggataggatgacaggaaagctggccccaaattctgccaccca caactttaggctcctggggcatagggatgggaggaaaaccccagttcccgagtgcgggctggaagacaggaggccggggttcttgtgt caggactgcccaggactggtgggtggcctggggcacactgctgccctttctgttgcctgtggtaagtgggggacaccagctgacacttcc tgcctgtcgtccccagagcctgctgacagcgcacgatcagttcaaggcaacactgcccgaggctgacC/Taggagcgaggtgccatc atgggcatccagggtgagatccagaagatctgccagacgtatgggctgcggccctgctccaccaatccctacatcacccTcagcccgc aggagcatcaacaccaagtgggatatggtcagtgccacctgcagccttcctcccaccccctcctgcatactgtgaccaccctgaaatctcg ggtggcccaagatatggagaataaagtccatcttcagatgtggggtctgccacagactccacgtgggattggataaatcgccttgcctgtc tcgggctca
Hình 2. 2. Vị trí các điểm cắt của enzyme DdeI trên trình tự gene ACTN3
Trong đoạn gene exon 16 ACTN3 này có 1 hoặc 2 điểm cắt của enzyme DdeI, tùy thuộc vào kiểu gene của từng ngƣời (Hình 2.1 và 2.2). Vì vậy, khi sử
dụng enzyme này để cắt sản phẩm PCR gene ACTN3 thì xảy ra các trƣờng hợp sau:
(i). Nếu cả 2 bản sao của exon 16 ACTN3 đều không có đột biến điểm C → T (đặc trƣng của alen R, kiểu gene RR) thì enzyme giới hạn chỉ nhận biết và cắt ở 1 vị trí, sản phẩm cắt là 2 đoạn DNA có kích thƣớc là 429 bp và 200 bp.
(ii). Nếu cả 2 bản sao của exon 16 ACTN3 đều có chứa đột biến điểm C →T (đặc trƣng của alen X, kiểu gene XX) thì enzyme giới hạn nhận biết và cắt tại 2 vị trí, sản phẩm cắt là 3 đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng là 332 bp, 97 bp và 200 bp.
(iii). Nếu 1 bản sao của exon 16 ACTN3 không có chứa đột biến điểm C → T, 1 bản sao còn lại có chứa đột biến điểm C → T (đặc trƣng cả alen R và X, kiểu gene RX) thì enzyme giới hạn cũng nhận biết và cắt tại 2 vị trí, tuy nhiên sản phẩm cắt là 4 đoạn DNA có kích thƣớc là 429 bp, 332 bp, 97 bp và 200 bp.
49
* Thành phần và điều kiện phản ứng cắt enzyme giới hạn DdeI (Bio Labs, Mỹ)
Phản ứng cắt đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Bảng 2.7). Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đó gel đƣợc nhuộm ethidium bromide. Đọc kết quả và chụp ảnh gel bằng hệ thống soi gel.
Bảng 2. 7. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt Enzyme giới hạn DdeI
Thành phần Thể tích (µL) Nƣớc Deion 7,5 10X buffer #3 2,0 Enzyme DdeI 0,5 Sản phẩm PCR tinh sạch 10 Tổng 20 Ủ ở 37ºC trong 6 tiếng 2.3.7. Phƣơng pháp điện di
Kỹ thuật điện di hoạt động dựa trên các quy luật điện từ, dƣới tác động của lực điện từ, các phân tử DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng và đƣợc phân tách khi di chuyển trong bản gel theo kích thƣớc và khối lƣợng phân tử của chúng. Do vậy, phân tử càng nhỏ thì càng dễ dàng xuyên qua các lỗ hổng trên bản gel, nó dịch chuyển nhanh hơn và xa hơn so với các phân tử có kích thƣớc lớn hơn. Do đó, bằng cách điện di DNA trên gel Agarose ta có thể phân biệt đƣợc các phân tử DNA có kích thƣớc khác nhau và có thể biết chính xác kích thƣớc của chúng dựa vào DNA thang chuẩn (Marker).
Trong nghiên cứu này, tùy thuộc vào từng mục đích và các giai đoạn kiểm tra: kiểm tra DNA tổng số sau tách chiết; kiểm tra sản phẩm PCR; kiểm tra sản phẩm cắt enzyme giới hạn … chúng tôi sẽ tiến hành điện di trên gel agarose với các nồng độ khác nhau tƣơng ứng là: 0,8%; 1,5% và 2%. Thời gian điện di từ 30 – 45 phút với hiệu điện thế 100V.
50
51
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Để có thể nhân thành công các gene ACE và ACTN3 từ các mẫu niêm mạc miệng và mẫu máu khô thu trên thẻ FTA của các đối tƣợng nghiên cứu, trƣớc tiên chúng tôi phải tiến hành tách chiết DNA tổng số của các mẫu. Kết quả của quá trình tách chiết DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu đƣợc trình bày ở dƣới đây
3.1. Tách chiết DNA tổng số
Mọi nghiên cứu sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết DNA là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn, hạn chế đứt gãy bởi tác nhân cơ học, nhiệt hay hóa học. Ngoài ra, việc tìm ra phƣơng pháp tách chiết DNA có chất lƣợng tốt từ các nguồn mẫu phù hợp với mục tiêu nghiên cứu cũng là một trong những vấn đề đƣợc chú trọng. Đặc biệt, trong các nghiên cứu mà đối tƣợng nghiên cứu chính là con ngƣời, ngoài tối ƣu hóa quy trình tách chiết DNA để thu đƣợc các mẫu DNA có chất lƣợng tốt, thì cũng cần quan tâm đến các yếu tố trong quá trình thu mẫu, bao gồm: việc thu mẫu có ảnh hƣởng đến đối tƣợng thí nghiệm không (xâm lấn hay không xâm lấn); nguy cơ bị nhiễm chéo trong quá trình thu mẫu... Một số loại mẫu phổ biến trong nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trên ngƣời đang đƣợc sử dụng hiện nay có thể kể đến nhƣ: mẫu máu, tóc, móng tay, móng chân, tế bào niêm mạc miệng…
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn 2 loại mẫu để khảo sát: mẫu tế bào niêm mạc miệng và mẫu máu khô thu trên thẻ FTA .
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu khô trên thẻ FTA
Việc tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu khô trên thẻ FTA đƣợc thực hiện theo quy trình tại mục 2.2.3. Nồng độ DNA tổng số đƣợc xác định bằng máy quang phổ Quawell Q3000 (Quawell, Mỹ) đạt từ 40 ng/μL đến 80 ng/μL. Độ tinh sạch của DNA đƣợc xác định thông qua tỷ số giữa hai bƣớc sóng λ260/280 nm
52 cho kết quả từ 1,80 đến 1,90. Chất lƣợng DNA tổng số còn đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.1.
(Giếng ký hiệu K: mẫu VĐV bộ môn chạy; Giếng ký hiệu B: mẫu VĐV bộ môn bơi; Giếng ký hiệu D: mẫu thuộc nhóm đối chứng)
3.1.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng
Việc tách chiết DNA tổng số từ mẫu tế bào niêm mạc miệng đƣợc thực hiện theo quy trình tại mục 2.2.3. DNA thu đƣợc sau tách chiết đƣợc chúng tôi tiến hành kiểm tra trên gel agarose 1 % (Hình 3. 2).
(Giếng M: Marker 100 bp; Giếng B: mẫu VĐV bộ môn bơi lội; Giếng (-): mẫu đối chứng âm)
Để kiểm tra độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA sau khi tách chiết, chúng tôi tiến hành do OD kiểm tra tỉ số OD260 nm/OD280 nm bằng máy quang phổ Quawell Q3000 (Quawell, Mỹ).Kết quả cho thấy nồng độ DNA tổng số đạt từ 24 ng/μL đến 70 ng/μL. Tỉ số OD260 nm/OD280 nm cho kết quả từ 1,80 đến 2,00.
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách từ mẫu máu trên thẻ FTA
Hình 3. 2. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách từ mẫu niêm mạc miệng
53 Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách thành công DNA tổng số từ cả 2 loại mẫu là mẫu tế bào niêm mạc miệng và mẫu máu trên thẻ FTA. DNA thu đƣợc từ hai phƣơng án tách chiết đều có chất lƣợng tốt, không bị đứt gãy và có độ tinh sạch cao, hàm lƣợng DNA đủ để làm các thí nghiệm tiếp theo.
So sánh giữa hai phƣơng pháp thu mẫu, chúng tôi thấy rằng việc sử dụng mẫu tế bào niêm mạc miệng để tách DNA tổng số của VĐV có nhiều ƣu điểm hơn so với sử dụng mẫu máu trên thẻ FTA, vì đây là mẫu rất dễ thu, đơn giản, không cần dụng cụ phức tạp để thu mẫu, đặc biệt là các VĐV có thể tự thu mẫu, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc triển khai ứng dụng xét nghiệm này trong tƣơng lai. Do vậy, mẫu tế bào niêm mạc miệng là loại mẫu đƣợc chúng tôi lựa chọn làm nguồn mẫu tách DNA tổng số cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả phân tích kiểu gene ACE
3.2.1. Kết quả khuếch đại gene ACE I/Dvới cặp mồi đặc hiệu
Gene ACE nằm trên nhiễm sắc thể 17, gene này có 20546 bp và gồm 25 exon. Sau quá trình phiên mã và thành thục mRNA, mRNA của ACE có 4195 base và
trực tiếp tổng hợp protein chứa 1306 axit amin. Tính đa hình của ACE I/D thể hiện ở sự có mặt (I – Insertion) hoặc vắng mặt (D – Deletion) của một trình tự lặp lại dài 287 bp trong intron 16. Ngƣời có kiểu gene đồng hợp tử DD có mức độ gene ACE hoạt động cao nhất và thấp nhất là ngƣời có kiểu gene đồng hợp II. Phần lớn các nghiên cứu đều cho thấy gene ACE có ảnh hƣởng tới sức bền và tốc độ của các VĐV. Trong đó alen I đƣợc coi nhƣ là alen có lợi đối với các VĐV thi đấu ở các nội dung đòi hỏi sức bền, còn alen D là alen có lợi cho các VĐV thi đấu ở các môn đòi hỏi tốc độ (Ian, 2006). Để phân biệt alen I và alen D chúng tôi đã đƣa ra phƣơng án thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR theo các yêu cầu sau: (1) đoạn khuếch đại có chứa vùng trình tự lặp lại dài 287 bp nằm trong intron 16; (2) kích thƣớc sản phẩm PCR phù hợp cho việc xác định 2 alen bằng điện di trên gel agarose; (3) hiệu suất của phản ứng PCR cao; (4) sản phẩm PCR khuếch đại đƣợc là sản phẩm đặc hiệu. Theo những tiêu chí trên và dựa vào dữ liệu đã đƣợc công bố
54 trên ngân hàng gene quốc tế (NC_000017, GeneBank), chúng tôi đã thiết kế một số cặp mồi nhƣ đƣợc trình bày tại bảng 2.1.
Qua các thí nghiệm tối ƣu, chúng tôi lựa chọn đƣợc cặp mồi phù hợp nhất cho mục đích nghiên cứu của đề tài là cặp mồi ACE-F và ACE-R2. Theo đó, với việc sử dụng cặp mồi này, chúng tôi sẽ khuếch đại đƣợc một đoạn trình tự dài 253 bp đối với alen D và 522 bp với alen I. Từ đó sẽ dễ dàng phân biệt đƣợc 3 kiểu gene ACE I/D là II; ID và DD bằng điện di trên gel agarose: (1) kiểu gene II, điện di trên gel agarose sẽ cho 1 băng, có kích thƣớc 522 bp; (2) kiểu gene ID, cho 2 băng, với kích thƣớc tƣơng ứng của alen I và alen D là 522 và 253 bp; (3) kiểu gene DD, cho 1 băng, kích thƣớc 253 bp. Dƣới đây là một số kết quả khuếch đại gene ACE bằng cặp mồi ACE-F và ACE-R2 mà chúng tôi đã thu đƣợc (Hình 3.3).
(Giếng M: Marker 1kb; Giếng ký hiệu K: mẫu vận động viên bộ môn chạy; Giếng ký hiệu B: mẫu vận động viên bộ môn bơi lội. Giếng (-): đối chứng âm)
Phân tích kết quả điện di hình 3.3 cho thấy đoạn DNA đƣợc khuếch đại có kích thƣớc tƣơng ứng với tính toán lý thuyết khi sử dụng cặp mồi ACE-F và ACE-R2. Các băng điện di rõ nét, không xuất hiện các sản phẩm phụ, khoảng cách giữa 2 băng đủ lớn, do vậy các kiểu gene II, ID và DD dễ dàng đƣợc phân biệt nhờ vào số lƣợng băng điện di xuất hiện và kích thƣớc của băng điện di. Nhƣ vậy, chúng tôi đã thiết kế đƣợc cặp mồi và tối ƣu hóa thành công phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gene ACE I/D.
55 Quy trình thí nghiệm này đƣợc chúng tôi thực hiện lần lƣợt để xác định kiểu gene ACE I/D cho tất cả các mẫu của các đối tƣợng nghiên cứu mà chúng tôi đã thu thập, kết quả thu đƣợc đƣợc trình bày tại bảng sau (Bảng 3.1, 3.2 và 3.3):
Bảng 3. 1. Kết quả xác định kiểu gene ACE I/D của các VĐV điền kinh
STT Ký hiệu mẫu
Họ và tên VĐV Nội dung thi đấu của VĐV Kiểu gene
1 K1 Đỗ Thị Thảo 800 m; 1500 m II
2 K2 Dƣơng Văn Thái 800 m; 1500 m ID
3 K3 Ngô Đăng Thanh 800 m; 1500 m DD
4 K4 Vũ Thị Ly 800 m; 1500 m II
5 K5 Nguyễn Văn Lý 1500 m; 3000 m ID
6 K6 Phạm Tiến Sản 1500 m; 3000 m ID
7 K7 Trƣơng Thanh Hằng 800 m; 1500 m ID
8 K8 Nguyễn Đặng Thanh Thúy 3000 m; 5000 m; 10000 m ID 9 K9 Phạm Thị Bình 10000 m; 21000 m; 42195m ID 10 K10 Nguyễn Thị Thanh Phúc 5000 m; 10000 m; 20000 m II 11 K11 Phan Thị Bích Hà 10000 m; 20000 m ID 12 K12 Nguyễn Thành Ngƣng 10000 m; 20000 m DD 13 K13 Võ Xuân Vĩnh 10000 m; 20000 m II 14 K14 Nguyễn Văn Đức 800 m; 1500 m II 15 K15 Hoàng Văn Dũng 1000 m; 1500 m II 16 K16 Lê Viết An 1000 m; 1500 m II 17 K17 Nguyễn Hoa Ri 800 m; 1500 m II
18 K18 Trƣơng Thị Thúy Kiều 800 m; 1500 m; 3000 m; 5000 m ID 19 K19 Trần Thị Thắm 800 m; 1500 m; 5000 m II 20 K20 Nguyễn Tuấn Trị 800 m; 1500 m; 3000 m II 21 K21 Quách Thị Lan 400 m; 400 m rào; 200 m ID
22 K22 Phạm Thị Diễm Nhảy cao DD
23 K23 Quách Công Lịch 400 m ID
24 K24 Lê Trọng Hinh 100 m; 400 m ID
25 K25 Nguyễn Văn Công Nhảy xa; 200 m II
26 K26 Nguyễn Văn Lai 5000 m, 10000 m DD
27 K27 Nguyễn Thị Oanh 100 m; 400 m; 400 m rào DD 28 K28 Nguyễn Thị Oanh 1500 m; 2000 m CNV; 3000 m
56
29 K29 Lê Trọng Giang 3000 m CNV; 5000 m II
30 K30 Nguyễn văn Mùa Nhảy xa II
31 K31 Nguyễn Thị Huyền 400 m rào DD
32 K32 Vũ Thùy Trang 400 m; 200 m II
33 K33 Đào Xuân Cƣờng 400 m rào; 4x400 m II
34 K34 NguyễnThịThúy 100 m; 200 m; 400 m II
35 K35 Đào Văn Thủy Nhảy cao DD
36 K36 Nguyễn Anh Tú 400 m rào; Tiếp sức 400 m II
37 K37 Nguyễn Ngọc Quang 100 m rào ID
38 K38 Trần Thị Mai 1000 m; 1500 m; 3000 m DD 39 K39 Lê Văn Thao 1500 m; 5000 m; 10000 m II
40 K40 Nguyễn Thị Hằng 400 m; 400 m rào ID
41 K41 Bùi Văn Đông Nhảy xa; Nhảy 3 bƣớc; 100 m ID
42 K42 Hoàng Văn Duy 400 m DD
43 K43 Hồ Xuân Tâm 400 m; 4x400 m tiếp sức II
44 K44 Đinh Văn Tùng 400 m II
45 K45 Trần Thanh Bình Nhảy cao II
46 K46 Nguyễn Thị Quỳnh Nhảy cao ID
47 K47 Vũ Thị Mến Nhảy xa; Chạy tiếp sức 4x100 m DD
48 K48 ĐàoThị Kim Oanh Nhảy xa; Nhảy cao ID
49 K49 Nguyễn Thị Mộng Mơ Nhảy xa; Nhảy cao ID 50 K50 Nguyễn Trƣờng Giang Điền kinh; ném lao II 51 K51 Dƣơng Thị Việt Anh Điền kinh; nhảy cao II 52 K52 Vũ Thị Hƣơng Điền kinh 100 m; 200 m II 53 K53 Nguyễn Thị Ngọc Thắm Điền kinh 4*100 m; 100 m II
54 K54 Trần Huệ Hoa Nhảy 3 bƣớc ID
Bảng 3. 2. Kết quả xác định kiểu gene ACE I/D của các VĐV Bơi lội
STT
Ký hiệu mẫu
Họ và tên VĐV Nội dung thi đấu của VĐV Kiểu gene
1 B1 Hoàng Quý Phƣớc 100 m E; 100 m TD II
2 B2 Nguyễn Văn Đạt 50 m B; 50 m S; 100 m S II
3 B3 Dƣơng Thị Thơm 100 m N ID
4 B4 Lê Thị Việt Trinh 50 m E; 100 m E; 200 m E II 5 B5 Ngân Thị Nhiên 50 m E; 100 m E; 200 m E ID
57
6 B6 Nguyễn Ngọc Triển 100 m N; 200 m N II
7 B7 Nguyễn Duy Thiện 50 m B; 100 m B; 50 m S ID
8 B8 Vũ Tấn Thành 50 m TD; 100 mTD II
9 B9 Lê Thị Hà My 50 m E; 100 m E; 200 m E ID 10 B10 Phạm Thị Yến 50 m N; 100 m N; 200 m N II 11 B11 Nguyễn Thị Kiều Oanh 50 m B; 100 m S DD
12 B12 Nguyễn Thị Hiền 50 m S; 100 m S ID
13 B13 Bùi Thị Thùy Dƣơng 50 m E; 100 m E; 200 m E II
14 B14 Phạm Đắc Thiên 50 m TD; 100 m TD II
15 B15 Nguyễn Văn Huỳnh 50 m N; 100 m N; 200 m N ID
16 B16 Trần Đức Tài 50 m E; 100 m E II
17 B17 Trần Văn Triệu 100 m N; 200 m N DD
18 B18 Ngô Thu Hà 100 m B; 100 m S ID
19 B19 Nguyễn Thị Ngọc Yến 100 m N; 200 m N, 50 m TD II
20 B20 Nguyễn Hữu Việt 50 E; 100E; 200E ID
21 B21 Lê Thị Mỹ Thảo 400 TD; 800 TD; 1500 TD; 50 B II 22 B22 Nguyễn Thị Diệu Linh 50 TD; 100 TD II 23 B23 Nguyễn Thị Ngọc Hân 50 E; 100 E; 200 E II