3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.5. Phương pháp ựịnh tên nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
3.3.5.1. Quy trình chiết DNA
DNA ựược tách chiết theo phương pháp ựược hiệu chỉnh bởi Gardes và Bruns (1993).
Dùng que cấy hoặc dao mổ sạch lấy khoảng 100 mg sợi nấm cho vào trong tube 1.5 mL. Chú ý không lấy theo môi trường agar.
Cho 500 ộL ựệm CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) vào tube. Dùng chày nhựa chuyên dụng nghiền nhuyễn nấm.
Ủ tube ở 650C trong thời gian 10 phút. Sau khi ủ, ựể tube khoảng 10 phút ựể nhiệt ựộ trở về nhiệt ựộ phòng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 24
Cho dung dịch Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với thể tắch tương ựương. Lắc nhẹ tube (không vortex).
Li tâm 13000 g trong 5 phút, thu phần dịch (~ 400 ộL). Chú ý không lấy phần phân giới chứa kết tủa.
Cho thể tắch tương ựương (~400 ộL) 2-propanol lạnh vào tube. đảo ựều tube và ựể lạnh (-200C) trong 30 phút.
Li tâm 13000 g trong 15 phút. Loại bỏ dịch phắa trên, thu lấy cặn DNA tổng số.
Rửa cặn bằng ethanol 70% hai lần (mỗi lần 0.7 Ờ 1 mL)
Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp tube, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút (trong buồng cấy).
Hòa cặn DNA trong 20-50 ộL nước cất 2 lần vô trùng hoặc ựệm TE và bảo quản dịch DNA ở -200C.
Kiểm tra chất lượng mẫu chiết DNA bằng ựiện di gel agarose (dùng 1- 2 ộL dịch DNA).
3.3.5.2. Nhân DNA của mẫu nấm bằng PCR và giải trình tự gen
Phản ứng PCR ựược thực hiện với cặp mồi ITS1 và ITS4 (White et al., 1990). điều kiện phản ứng: Các phản ứng PCR ựược thực hiện trong tube 0,5 mL với tổng thể tắch phản ứng 25 ộL, thành phần của mỗi phản ứng PCR: H2O : 20,2ộl Bf : 2ộl dNTPs : 0,5ộl ITS4 : 0,5ộl ITS5 : 0,5ộl Blend Taq : 0,3ộl DNA : 1ộl
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 25 Quy trình thực hiện phản ứng PCR: 94oC 4 phút x 1 94 oC 50 oC 72 oC 30 giây 40 giây 1 phút x 35 72 oC 5 phút x 1 3.3.5.3. Chạy ựiện di
Chuẩn bị: Pha ựệm ựiện di TAE1x từ dung dịch gốc TAE sản xuất: lấy 100ml TAE5x cho vào cốc ựong, bổ sung 400ml nước cất lắc ựều. Chuẩn bị bản gel: cân 1g agarose cho vào 100ml TAE1x sau ựó lắc nhẹ lọ ựể hòa tan agarose. Sau ựó, ựun trong lò vi sóng 3 Ờ 4Ỗ, bổ sung Ethidium Bromide theo tỉ lệ cứ 100ml dung dịch gel cho 4ộl lắc ựều, ựể lọ ở nhiệt ựộ phòng. Khi dung dịch agarose 1% nằm trong khoảng 400C thì ựổ vào khuôn có ựặt lược tạo lỗ khuôn. để khuôn ở nhiệt ựộ phòng. Lấy các tube 0.5ml chứa các sản phẩm PCR ựánh số thứ tự cho vào mỗi tube 4ộl loading Dye X6, ựảo ựều và spin trong 5 giây.
Tiến hành: Sau 30 giây ựể khuôn ở nhiệt ựộ phòng thì tiến hành rút lược. đặt cả khay khuôn gel vào bể ựiện di, ựổ dung dịch ựệm TAE1X phủ ngập gel. Nhỏ mẫu vào giếng: dùng pipet hút 7 Ờ 10ộl dung dịch mẫu cần chẩn ựoán cho vào mỗi giếng theo thứ tự. Ngoài các mẫu chạy PCR còn nhỏ thêm 1 giếng marker làm chuẩn. Cắm nguồn ựiện cho máy ựiện di. đặt ở hiệu ựiện thế 100V trong 25Ỗ, tắt máy ựiện di, ựặt bản gel ựược kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.
3.3.5.4. Xác ựịnh các mẫu nấm bằng giải trình tự vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của RNA ribosome
Nguồn nấm
Các mẫu nấm ựược nuôi cấy thuần trên môi trường PDA trước khi phân tắch
Lựa chọn vùng gen nghiên cứu
Hiện nay, vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) của cụm gen rDNA là một trong các vùng gen phổ biến nhất ựể nghiên cứu ựa dạng và xác ựịnh nhiều loài nấm. Các rDNA của nấm ựược tổ chức thành các ựơn vị phiên mã. Mỗi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 26
ựơn vị phiên mã có thể ựược lặp lại nhiều lần trên bộ genome. Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các ựơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm ựơn vị phiên mã. Một ựơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S- 5.8S-28S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS ký hiệu là ITS1 ở ựầu 5Ỗ và ITS2 ở ựầu 3Ỗ (Hình 2.1 ).
Hình 2.1. Sơ ựồ minh họa các cụm gen ITS của sinh vật nhân thật.
Vùng ITS1 và ITS2 ựược chỉ bằng mũi tên.
PCR và giải trình tự
DNA ựược chiết từ các mẫu nấm nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). DNA ựược hòa trong 50 uL ựệm TE và bảo quản ở -20 OC.
Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) ựã ựược sử dụng ựể nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm.
Phản ứng PCR ựược thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với nhiệt ựộ gắn mồi ở 54 OC.
Sản phẩm PCR ựược tinh chiết từ gel agarose dùng kắt tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR ựược giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR tại Công ty Microgen (Hàn Quốc). Trình tự nucleotide ựược biên tập và lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27
Phân tắch trình tự
Dựa trên các trình tự thu ựược, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for
Biotechnology Information).
Phân tắch trình tự ựược thực hiện dùng các phầm mềm ClustalX và MEGA5.1.