Kết quả phân tích trình tự ADN vùng D-loop ty thể của 21 mẫu sau khi đƣợc xác định thuộc loài bò rừng, trong đó có 1 mẫu bò rừng ở Campuchia và 20 mẫu ở Việt Nam (khu bảo tồn Ea Sô 14 mẫu, vƣờn quốc gia Bù Gia Mập 3 mẫu, vƣờn quốc gia Yok Đôn 1 mẫu và khu bảo tồn Krông Trai 1 mẫu), cho thấy chỉ có 3 kiểu haplotype đƣợc xác định (Hình 3.17 và 3.18). Trong đó kiểu haplotype 1 và 2 đƣợc xác định ở các mẫu bò rừng Việt Nam, kiểu haplotype 3 thuộc bò rừng ở Campuchia. Riêng ở khu vực Ea Sô, bao gồm cả 2 kiểu haplotype.
Sự đa dạng về kiểu haplotype và trình tự các nucleotide giữa các kiểu haplotype đƣợc xác định ở quần thể bò rừng Việt Nam và Campuchia là rất nhỏ. Chỉ có 9 vị trí nucleotide sai khác giữa 2 kiểu haplotype của bò rừng Việt Nam và 11 vị trí nucleotide sai khác giữa bò rừng Việt Nam so với bò rừng ở Campuchia. Do đó, sự sai khác về di truyền giữa các kiểu halotype này là rất nhỏ, đặc biệt không có sự sai khác di truyền đáng kể giữa các mẫu bò rừng của Việt Nam và Campuchia (Bảng 3.11). Các mẫu bò rừng này thuộc cùng một loài phụ vì theo Byers và cộng sự (1995) thì bò rừng Viêt Nam và bò rừng Campuchia, Lào, Myanma, Thái Lan thuộc cùng loại phụ Bos javanicus birmanicus. Chƣa có ghi nhận nào về loài phụ bò rừng khác ở khu vực Đông Dƣơng.
Nhƣ vậy, tƣơng tự nhƣ ở quần thể bò tót, tính đa dạng di truyền ở quần thể bò rừng ở Việt Nam hiện nay là rất thấp. Điều này hoàn toàn phù hợp với thực tế trƣớc tình trạng báo động về nguy cơ tuyệt chủng của loài bò hoang dã này ở Việt Nam. Do rất nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣ phá huỷ môi trƣờng sống, săn bắn trái phép, dịch bệnh đã dẫn đến số lƣợng bị giảm sút, hiện tại chỉ còn dƣới 100 cá thể, cơ cấu đàn bị xé lẻ bị cô lập và không có khả năng trao đổi di truyền do vậy đã dẫn đến tính đồng huyết tăng cao.
Bảng 3.11: Ma trận khoảng cách di truyền giữa bò rừng mang các kiểu haplotype khác nhau
Haplotype 1 Haplotype 2 Haplotype 3 Haplotype 1
Haplotype 2 0,009
Haplotype 3 0,009 0,008
Haplotype 1: Mẫu bò rừng Việt Nam Haplotype 2: Mẫu bò rừng Việt Nam Haplotype 3: Mẫu bò rừng Campuchia
Bên cạnh việc phân tích hệ gen ty thể, chúng tôi cũng đã tiến hành áp dụng các locút microsatellite của bò nuôi để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của hệ gen nhân ở quần thể bò tót và bò rừng hoang dã. Mặc dù chúng tôi cũng đã thu đƣợc kết quả kiểu gen của một số locút microsatllite tuy nhiên những kết quả này chƣa thực sự đáng tin cậy bởi vậy chúng tôi không thể thực hiện các phân tích tiếp theo. Nguyên nhân nhƣ chúng tôi đã thảo luận ở trên, do kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân thƣờng có nộng độ ADN của bò không cao, hơn nữa thƣờng bị đứt gãy và pha tạp bởi rất nhiều nguồn ADN của các sinh vật khác nhau vì vậy đã làm ức chế phản ứng PCR đối với các cặp mồi microsatellite dẫn đến làm cho phản ứng PCR không thể thực hiện hoặc là cho kết quả các alen giả (alen không chính xác). Chính vì vậy, để đảm bảo độ chính xác của các alen thu đƣợc, ở một vài nghiên cứu đã công bố trên các đối tƣợng động vật hoang dã khác, các tác giả thƣờng phải tiến hành phản ứng nhân ADN đặc hiệu (PCR) lặp lại 3 lần đối với mỗi locút microsatellite nhƣng tỷ lệ thành công cũng rất thấp [20], [56], [124].
Hình 3.17: So sánh trình tự ADN giữa các kiểu haplotype ở quần thể bò rừng (Haplotype 1và 2: mẫu bò rừng Việt Nam; Haplotype 3: mẫu bò rừng Campuchia)
CAT T IEN449 CAT T IEN7 CAT T IEN3N CAT T IEN250 CAT T IEN463 EA SO3 CAT T IEN211 EA SO12 CAT T IEN169 CAT T IEN132 CAT T IEN361 T HAO CAM VIEN CAT T IEN9 CAT T IEN324 CAT T IEN419 CAT T IEN459 CAT T IEN74 BU GIA MAP CAT T IEN82 CAT T IEN171 CAT T IEN470 CAT T IEN388 CAT T IEN241 CAT T IEN405 CAT T IEN409 CAT T IEN412 CAT T IEN25 CAT T IEN252 CAT T IEN418 CAT T IEN420 CAT T IEN52 CAT T IEN398 CAT T IEN162 CAT T IEN396 CAT T IEN246 CAT T IEN348 CAT T IEN249 CAT T IEN421 EA SO2 CAMPUCHIA1 DAN MACH1 PARI ZOO1 DAN MACH2 PARI ZOO2 CAMPUCHIA2 CAT T IEN340 CAT T IEN200 CAT T IEN345 CAT T IEN294 CAT T IEN1 CAT T IEN300 CAT T IEN330 CAT T IEN199 CAT T IEN325 CAT T IEN143 CAT T IEN12N CAT T IEN16N INDIA DQ377061 INDIA DQ377056 INDIA DQ377057 INDIA DQ377058 INDIA DQ377059 T AY BAN NHA3 INDIA DQ377060 T AY BAN NHA4 T AY BAN NHA1 T AY BAN NHA2 KRONG T RAI EA SO11 EA SO1 BU GIA MAP1 EA SO17 EA SO7 CAMPUCHIA (B Javanicus) EA SO10 YOK DON EA SO13 EA SO14 EA SO4 EA SO15 EO SO5 EA SO6 EA SO8 BU GIA MAP3 EA SO16 EA SO9 BU GIA MAP2 BOS GRUNNIES BISON BONAS BOS T AURUS BOS INDICUS 100 82 98 97 43 100 89 41 61 24 56 99 99 93 100 97 97 87 96 54 83 0.02 Bò tót Bò tót của Việt Nam mang kiểu haplotype 1, bò tót Campuchia, Đan Mạch và vƣờn thú Pari-Pháp (Lào) Bò tót Bò tót của Việt Nam mang kiểu haplotype 2 Bò tót Các mẫu bò tót ở Ấn Độ và Tây Ban Nha Bò rừng: Các mẫu bò rừng Việt Nam và Campuchia Hình 3.18: Cây phân loại di
truyền giữa bò tót, bò rừng, bò Tây Tạng (Bos grunnies), bò rừng châu Âu (Bison bonas) và bò nuôi (Bos taurus, Bos indicus). Hoành độ của cây thể hiện khoảng cách di truyền. Các số giữa các gốc nhánh là giá trị bootstrap
KẾT LUẬN
1. Bò nuôi tại tỉnh Hà Giang có tính đa dạng di truyền cao ở các locút microsatllite của hệ gen nhân và trình tự ADN vùng D-loop của hệ gen ty thể. Trong số 23 locút microsatellite nghiên cứu đã xác định đƣợc 205 alen khác nhau. Số lƣợng alen và tần số dị hợp tử trung bình của mỗi locút tƣơng ứng là 8,9 và 0,73. Hầu hết các locút microsatellite đều không ở trạng thái cân bằng di truyền Hardy-Weinberg, do đó xét trên phƣơng diện tổng thể thì bò nuôi tại Hà Giang không cân bằng di truyền Hardy-Weinberg (p<0,01). Ngoài ra, đã xác định đƣợc 14 kiểu haloptype hệ gen ty thể của bò nuôi ở tỉnh Hà Giang và giữa 14 kiểu haplotype có 34 điểm đa hình trình tự nucleotide.
2. Bò nuôi tại tỉnh Hà Giang có nguồn gốc từ sự lai tạp giữa hai loài phụ Bos taurus
(bò không có u) và Bos indicus (bò có u). Trong đó, tỷ lệ bò có nguồn gốc thuộc loài phụ Bos taurus và Bos indicus tƣơng ứng là 46% và 54%.
3. Cấu trúc di truyền quần thể bò nuôi ở Hà Giang phân thành hai nhóm bò khác nhau về di truyền (quần thể phụ), hai nhóm bò này phân bố chính ở hai khu vực tiểu sinh thái khác nhau: vùng cao núi đá (Đồng Văn, Mèo Vạc) và vùng cao núi đất (Hoàng Su Phì, Xín Mần).
4. Tỷ lệ tách chiết ADN thành công từ các mẫu phân bò hoang dã là khoảng 40%. Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu mẫu phân đã ảnh hƣởng đến kết quả tách chiết ADN: các mẫu phân có thời gian bảo quản càng ngắn (tính từ khi đƣợc thu thập đến khi tiến hành tách chiết ADN) thì tỷ lệ tách chiết ADN thành công càng cao, các mẫu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ 40C cho kết quả cao hơn các mẫu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ ngoài trời. Không có sự khác nhau giữa phƣơng pháp bảo quản bằng dung dịch cồn (100%) và dung dịch bảo quản RNAlater đến kết quả tách chiết ADN. 5. Đã áp dụng thành công một số chỉ thị phân tử của bò nuôi nhƣ phân tích trình tự ADN vùng D-loop, phân tích đoạn gen đặc trƣng trên nhiễm sắc thể Y để xác định loài và giới tính ở bò tót và bò rừng hoang dã.
6. Đã xác định đƣợc 5 kiểu haplotype hệ gen ty thể trong quần thể bò tót ở khu vực Đông Dƣơng bao gồm Việt Nam (2), Lào (1) và Campuchia (2). Trong đó ở quần thể bò tót của Việt Nam đã xác định 2 kiểu haplotype có khoảng cách di truyền rất xa nhau. Qua đó cho thấy trong quần thể bò tót của Việt Nam tồn tại 2 nhóm rất khác nhau về di truyền.
7. Đã xác định đƣợc 2 kiểu haplotype hệ gen ty thể ở quần thể bò rừng Việt Nam và 1 kiểu haplotype ở quần thể bò rừng của Campuchia. Không có sự sai khác di truyền đáng kể giữa các kiểu haplotype của bò rừng ở Việt Nam và bò rừng ở Campuchia.
8. Quần thể bò tót và bò rừng ở Việt Nam có tính đa dạng di truyền rất thấp thể hiện qua việc rất ít kiểu haplotype hệ gen ty thể đƣợc xác định.
ĐỀ NGHỊ
1. Khi xây dựng các đề tài, dự án bảo tồn quần thể bò ở Hà Giang nên chủ yếu tập trung bảo tồn hai nhóm bò có sự khác nhau về di truyền ở các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc và Hoàng Su Phì, Xín Mần.
2. Cần tiến hành mở rộng nghiên cứu nhằm đánh giá đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền trên các quần thể bò vàng bản địa khác của Việt Nam nhƣ: bò vàng Lạng Sơn, Thanh Hoá, Nghệ An, U đầu rìu, Bà Rịa Vũng Tàu, Phú Yên. So sánh sự sai khác và tính đa dạng di truyền giữa các nhóm bò vàng địa phƣơng của Việt Nam. 3. Cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể bò tót và bò rừng đƣợc ghi nhận tồn tại ở tất cả các khu vực của Việt Nam.
4. Tiến hành so sánh đặc điểm hình thái và di truyền của 3 loài phụ bò tót để xác định liệu 2 nhóm bò đƣợc xác định ở Việt Nam có phải là các loài phụ khác nhau hay không.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Trần Xuân Hoàn, Vũ Chí Cƣơng, Lê Đình Lƣơng và J.C. Maillard (2008), “Phân tích đa dạng trình tự nucleotide ADN ty thể và mối quan hệ di truyền của bò H’mông với một số quần thể bò khác”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi. Số 13, trang 51-57.
2. Taiana Rivière-Dobigny, Lan Pham Doan, Nam Le Quang, Jean-Charles Maillard and Johan Michaux (2008), “Species Identification, Molecular Sexing and Genotyping Using Non-invasive Approaches in Two Wild Bovids Species:
Bos gaurus and Bos javanicus” Journal of Zoo Biology. 28 (2), pp. 127-136 3. Phạm Doãn Lân, Nguyễn Trọng Bình, Vũ Chí Cƣơng, Jean-Charles Maillard,
(2008), “Sử dụng kỹ thuật microsatellite để đánh giá tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của quần thể bò nuôi ở tỉnh Hà Giang” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. Số 4 (24), trang 310-317.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1]. Nguyễn Văn Cƣờng, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Nguyễn Thu Thuỷ, Đậu Hùng Anh, Nguyễn Đăng Vang (2003), “So sánh tính đa hình gen RYR-1 và gen FSH ở lợn nội và lợn ngoại”, Tạp chí Công nghệ Sinh học. Số 1 (1), trang. 39-46
[2]. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (1997), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục [3]. Nguyễn Mạnh Hà (2008), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học-sinh thái và
bảo tồn loài bò tót (Bos gaurus Smith, 1827) ở Việt Nam, Luận án Tiến sỹ, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
[4]. Nông Văn Hải, Lê Thị Thu Hiền, Kim Thị Phƣơng Oanh, Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Đặng Văn Hạnh, Nguyễn Huy Hoàng, Trần Thị Phƣơng Liên, Lê Trần Bình (1999), “Ứng dụng công nghệ DNA trong nghiên cứu tài nguyên động vật và thực vật Việt Nam”, Báo cáo khoa học hội nghị sinh học toàn quốc, Hà Nội. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, trang. 1197-1204.
[5]. Nguyễn Văn Hậu, Nhữ Văn Thụ, Phạm Doãn Lân, Lê Thị Thuý (2000), “Phân tích trình tự nucleotide gen hormon sinh trƣởng của một số giống lợn nội Việt Nam”, Tạp chí di truyền & ứng dụng. Số 3, trang 6-10.
[6]. Trần Xuân Hoàn (2002), Nghiên cứu sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng của một số giống gà của Việt Nam, Luận án Tiến sỹ, Đại học Quốc gia Hà Nội.
[7]. Đặng Huy Huỳnh (1986), Sinh học và sinh thái học các loài thú móng guốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội
[8]. Lê Đình Lƣơng (2001), Nguyên lý và Kỹ thuật Di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
[9]. Lê Viết Ly, Hoàng Kim Giao, Mai Văn Sánh, Võ Văn Sự, Lê Minh Sắt (1999), Chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam. Tập I: Phần gia súc . Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.
[10]. Phan Cự Nhân (1982), “Sử dụng các chỉ tiêu di truyền sinh hóa protein máu, sữa trong công tác giống gia súc”, Khoa học và kỹ thuật nông nghiệp. Số 241, trang. 311-314.
[11]. Niên giám thống kê (2007). Nhà xuất bản thống kê, Hà Nội
[12]. Lê Minh Sắt, Nguyễn Văn Hậu, Nhữ Văn Thụ, Phạm Doãn Lân (1999), “Kết quả xác định kiểu gen halothan ở lợn bằng kỹ thuật nhân gen (PCR). Di truyền học & ứng dụng. Số 2, trang. 1-5.
[13]. Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Chú giải di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục, trang. 164.
[14]. Lê Thị Thuý, Lƣu Quang Minh, Trần Thu Thuỷ, Nguyễn Trọng Bình, Phạm Doãn Lân, Nguyễn Đăng Vang (2005), “Phân tích đa hình gen mã hoá thụ thể Oestrogen (Oestrogen Receptor-ESR) ở một số giống lợn nuôi tại Việt nam” Tạp chí Công nghệ sinh học. Số 3 (1), trang. 45-50.
Tài liệu tiếng Anh
[15]. Anderson S., De Bruijn M., Coulson A., Eperon I., Sanger F. and Young I. (1982), “Complete sequence of bovine mitochondrial DNA. Conserved features of the mammalian mitochondrial genome”, Journal of Molecular Biology. 156 (4), pp. 683-717.
[16]. Avise J.C. (1994), Molecular Markers, Natural History and Evolution (1st ed.), New York: Chapman & Hall.
[17]. Belkhir K., Borsa P., Chikhi L., Raufaste N. and Bonhomme F. (2004),
GENETIX 4.05, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier (France).
[18]. Bell C.J. and Ecker J.R. (1994), “Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis”, Genomics. 19 (1), pp. 137-144.
[19]. Bell K. (1983), The blood groups of domestic mammals: Red Blood Cells of Domestic Mammals, Amsterdam: Elsevier, pp. 133-164.
[20]. Bellemain E., Nawaz M., Valentini A., Swenson J. and Taberlet P. (2007), “Genetic tracking of the brown bear in northern Pakistan and implications for conservation”, Biological Conservation. 134 (4), pp. 537-547.
[21]. Bellemain E., Swenson J., Tallmon D., Brunberg S. and Taberlet P. (2005), “Estimating population size of elusive animals with DNA from hunter- collected feces: four methods for brown bears”, Conservation Biology. 19 (1), pp.150-161.
[22]. Bhat P., Mishra B. and Bhat P. (1990), “Polymorphism of mitochondrial DNA (mtDNA) in cattle and buffaloes”, Biochemical Genetics. 28 (7), pp. 311-318.
[23]. Bongso T., Hilmi M., Sopian M. and Zulkifli S. (1988), “Chromosomes of gaur cross domestic cattle hybrids”, Research in Veterinary Science. 44 (2), pp. 251-254.
[24]. Boom R., Sol C., Salimans M., Jansen C., Wertheim-van Dillen P. and Van der Noordaa J. (1990), “Rapid and simple method for purification of nucleic acids”, Journal of Clinical Microbiology. 28 (3), pp. 495-503.
[25]. Botstein D., White R.L., Skolnick M. and Davis R.W. (1980), “Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms”, American Journal of Human Genetics. 32 (3), pp. 314-331. [26]. Bradley D. G., MacHugh D. E., Loftus R. T., Sow R. S., Hoste C. H. and Cunningham E. P. (1994), “Zebu-taurine variation in Y chromosomal DNA: a sensitive assay for genetic introgression in west African trypanotolerant cattle populations”, Animal Genetics. 25 (1), pp. 7-12.
[27]. Bradley D., MacHugh D.E., Cunningham P. and Loftus R. (1996), “Mitochondrial diversity and the origins of African and European cattle”,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 93 (10), pp. 5131- 5135.
[28]. Bradshaw C., Isagi, Y., Kaneko S., Brook B., Bowman D. and Frankham R., (2007), “Low genetic diversity in the bottlenecked population of endangered non-native banteng in northern Australia”, Molecular Ecology. 16 (14), pp. 2998-3008.
[29]. Brenneman R., Chase JC., Olson T., Riley D. and Coleman S. (2007), “Genetic diversity among Angus, American Brahman, Senepol and Romosinuano cattle breeds”, Animal Genetics. 38 (1), pp. 50-53.
[30]. Britten R.J., Kohne D.E. (1968), “Repeated sequences in DNA”, Science. 161, pp. 529-540.
[31]. Byers O., Hedges S. and Seal U.S. (1995), Asian Wild Cattle Conservation Assesment and Management Plan Workshop. Working Document. Apple Valley, MN, USA: IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. [32]. Cai X., Chen H., Lei C., Wang S., Xue K. and Zhang B. (2007), “mtDNA
diversity and genetic lineages of eighteen cattle breeds from Bos taurus and
Bos indicus in China”, Genetica. 131 (2), pp. 175-183.
[33]. Canon J., Alexandrino P., Bessa I., Carleos C., Carretero Y., Dunner S., Ferran N., Garcia D., Jordana J. and Laloe D. (2001), “Genetic diversity measures of local European beef cattle breeds for conservation purposes”,
Genetics Selection Evolution. 33 (3), pp. 311-332.
[34]. Canon J., Checa M., Carleos C., Vega-Pla J., Vallejo M. and Dunner S. (2000), “The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data”, Animal Genetics. 31 (1), pp. 39.
[35]. Cavalli–Sforza L.L., Menozzi P. and Piazza A. (1994), The History and Geography of Human Genes, Princeton, N.J. Princeton University Press. [36]. Condit R. and Hubbell S. (1991), “Abundance and DNA sequence of two-
base repeat regions in tropical tree genomes”, Genome. 34(1), pp. 66-71. [37]. Cozzi M., Strillacci M., Valiati P., Bighignoli B., Cancedda M. and Zanotti
M. (2004), “Mitochondrial D-loop sequence variation among Italian horse breeds”, Genetics Selection Evolution. 36, pp. 663-672.
[38]. Crooijmans R., Kampen A., Poel J. and Groenen M. (1993), “Highly polymorphic microsatellite markers in poultry”, Animal Genetics. 24 (6), pp. 441- 443.
[39]. Cuc N., Muchadeyi F., Baulain U., Eding H., Weigend S. and Wollny C. (2006), “An assessment of genetic diversity of Vietnamese H'mong