Quy trình tách chiết ADN từ các mẫu phân đƣợc chúng tôi sử dụng và cải tiến từ quy trình của bộ kít tách QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng Qiagen (Đức). Bộ kít này cho phép tách chiết ADN từ nhiều nguồn khác nhau có trong mẫu phân nhƣ: vi khuẩn, thực vật và các tế bào biểu mô ruột của vật chủ.
Trong các mẫu phân của bò thải ra có chứa một lƣợng tế bào biểu mô ruột, tuy nhiên số lƣợng này là rất ít vì vậy để tăng khả năng thu đƣợc nguồn ADN, chúng tôi đã cải tiến ở một số bƣớc quy trình tách chiết của bộ kít nhƣ sau:
Thay vì sử dụng 200 mg mẫu phân theo quy trình của bộ kít chúng tôi đã sử dụng tăng lên đến 400 -500 mg. Nếu các mẫu đƣợc bảo quản ở dạng dung dịch thì sử dụng ly tâm để loại bỏ phần dịch chỉ giữ lại phần cặn.
Mỗi mẫu phân tiến hành tách chiết ADN làm 2 lần khác nhau sau đó mẫu ADN đƣợc gộp chung vào làm một ống.
Để ADN tủa tốt, sau khi thêm dung dịch ethanol lạnh, các mẫu tiếp tục đƣợc đặt vào khay đá trong 15 phút.
Trƣớc khi hoà tan ADN trong các màng lọc của bộ kít, dung dịch AE (QIAamp DNA Stool Mini Kit) đƣợc ủ đến nhiệt độ 700C.
Các bƣớc còn lại đƣợc thực hiện theo quy trình khuyến cáo của bộ kít. Đối với các mẫu mô và máu, chúng tôi áp dụng theo quy trình khuyến cáo của bộ kít tách ADN cho mẫu máu và mô nhƣ đã sử dụng cho các mẫu bò nuôi.
2.2.2.3. Xác đinh sự ảnh hưởng của một số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN
Để khảo sát sự ảnh hƣởng của một số yếu tố bảo quản mẫu: (1) nhiệt độ bảo quản mẫu, (2) dung dịch bảo quản mẫu, (3) thời gian bảo quan mẫu đến kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân bò hoang dã, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên mẫu phân bò tót (Bos gaurus) thu ở Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu phân này đƣợc bảo quản trong các điều kiện khác nhau nhƣ ở bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các điều kiện bảo quản mẫu phân bò nhằm xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả tách chiết ADN
Điều kiện bảo quản mẫu phân
Nhiệt độ bảo quản (0C)
Dung dịch bảo quản
Thời gian bảo quản (ngày) 1 Khoảng 350C Không 2, 10, 20, 30 2 Khoảng 350C Cồn (100%) 2, 10, 20, 30 3 Khoảng 350C RNAlater 2, 10, 20, 30 4 40C Không 2, 10, 20, 30 5 40C Cồn (100%) 2, 10, 20, 30 6 40C RNA later 2, 10, 20, 30
2.2.2.4. Xác định loài và giới tính Xác định loài Xác định loài
Để xác định các mẫu thu đƣợc thuộc loài bò tót (Bos gaurus), bò rừng (Bos javanicus), bò nuôi (Bos indicus hay Bos taurus), chúng tôi đã tiến hành phân tích trình tự ADN một trong hai đoạn gen cytochrome b (cyt b) hoặc vùng D-loop của ADN ty thể.
Cặp mồi nhân đoạn gen cyt b có độ dài 274 bp đƣợc thiết kế bởi Hasanin và cộng sự 2006 [51] dựa trên trình tự của bò nuôi nhƣ sau:
L15612: 5’-CGATCAATYCCYAAYAAACTAGG-3’ H15915: 5’-TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngƣợc, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas) và 100-200 ng ADN khuôn. Điều kiện phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92o
C trong 1 phút, gắn mồi ở 520 C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 720C trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 720
C trong 10 phút.
Cặp mồi nhân đoạn ADN vùng D-loop đƣợc áp dụng từ cặp mồi đã đƣợc chúng tôi thiết kế và sử dụng cho bò nuôi có kích thƣớc 990 bp.
Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’
Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Thành phần và điều kiện phản ứng PCR nhân vùng D-loop đƣợc thực hiện nhƣ đã tiến hành đối với các mẫu bò nuôi, chỉ có một sự thay đổi nhỏ đó là nồng độ ADN khuôn đƣợc tăng gấp 2 lần so với ở bò nuôi.
Xác định giới tính
Chúng tôi sử dụng cặp mồi dùng để xác định giới tính phôi bò nuôi đƣợc thiết kế bởi Kageyama và cộng sự (2004) [59] có trình tự sau:
S4BF: 5’-CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG-3’
S4BR: 5’-GAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT-3’
Điều kiện phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 25 µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngƣợc, 50-100 ng ADN khuôn và 1,5 Unit Taq DNA polymerase (Qiagen-Đức). Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94o
C trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92o
C trong 1 phút, gắn mồi ở 52o
C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc xác định trên điện di agarose 3%.
Sản phẩm PCR của cặp mồi này sẽ là một đoạn gen đặc trƣng trên nhiễm sắc thể Y của bò có kích thƣớc 178 bp và một đoạn gen khác có ở cả hai giới tính đực và cái có kích thƣớc 145 bp.
2.2.2.5. Phân tích đa dạng di truyền
Sau khi nhân PCR vùng D-loop ty thể từ các mẫu ADN tách chiết đƣợc, các mẫu cho kết quả PCR dƣơng tính đƣợc tiến hành giải trình tự tại Phòng thí nghiệm trọng điểm - Viện Chăn Nuôi và Công ty Macrogen (Hàn Quốc) nhƣ đã thực hiện trên các mẫu bò nuôi.
Trình tự ADN sau đó đƣợc phân tích và so sánh với trình tự của một số mẫu thuộc họ bò có sẵn trên ngân hàng gen (GeneBank) bao gồm: bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus), bò hoang dã (Bos gaurus, Bos javanicus), Bos grunies, Bò rừng Châu Âu (Bos bonas) và bò rừng Châu Mỹ (Bos bison).
Sự sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể của các mẫu đƣợc phân tích bằng phần mềm BIOEDIT.
Xác định các haplotype và khoảng cách di truyền giữa các nhóm bò hoang dã mang các kiểu haplotype khác nhau bằng các phần mềm DNAsp và MEGA phiên bản 4.0.
Xây dựng cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các mẫu bò hoang dã (Bos gaurus, Bos javanicus) ở Việt Nam và một số nơi khác, bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus), bò Tây Tạng (Bos grunies), Bò rừng Châu Âu (Bos bonas) bằng phần mềm MEGA phiên bản 4.0
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3. 1. ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ NUÔI TẠI HÀ GIANG
3.1.1. Tính đa dạng về kiểu hình
3.1.1.1. Đa dạng về màu sắc lông
Kết quả phân tích về màu sắc lông cho thấy bò nuôi ở tỉnh Hà Giang có màu sắc rất đa dạng trong đó màu vàng chiếm tỷ lệ cao nhất (36%), màu đỏ cánh gián chiếm 22%, vàng hoe chiếm 21%, màu đen chiếm 15%, đen và đỏ chiếm 3%, đen vàng chiếm 2%, vàng và trắng chiếm 1%. Nhƣ vậy màu vàng, đỏ cánh gián, vàng hoe và màu đen chiếm chủ yếu trong số mẫu bò đƣợc nghiên cứu (Hình 3.1)
36%
22% 15%
21%
3% 2% 1%
Hình 3.1: Biểu đồ phân bố sự đa dạng màu sắc lông của quần thể bò ở Hà Giang
3.1.1.2. Đa dạng về hình dáng sừng
Đặc điểm hình dáng sừng có 3 loại chủ yếu: sừng thẳng đứng (40%), sừng hƣớng về phía trƣớc (38%), hƣớng ngang sang 2 bên (22%). Tỷ lệ sừng thẳng đứng và hƣớng về phía trƣớc là tƣơng đƣơng trong khi sừng hƣớng ngang có tỷ lệ thấp nhất (Hình 3.2).
Thẳng đứng 40% Hướng trước 38% Hướng ngang 22%
Hình 3.2: Biểu đồ phân bố sự đa dạng hình dáng sừng của quần thể bò ở Hà Giang
3.1.2. Tính đa dạng về di truyền
3.1.2.1. Kết quả phân tích kích thước alen của các locút microsatellites
Tổng số 30 locút microsatellites đƣợc thực hiện chuẩn hóa trong 6 phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR) và kích thƣớc các alen của mỗi locút sau đó đƣợc xác định bằng máy giải trình tự CEQ8000 của hãng Beckman Coulter (Hình 3.3). Trong số 30 locút nghiên cứu thì chỉ có 2 locút không cho kết quả sau khi thực hiện phản ứng nhân gen PCR là TGLA53 ở phản ứng multiplex PCR số 3 và HAUT24 ở phản ứng multiplex PCR số 4. Hai mƣơi tám locút còn lại đều cho kết quả trong các phản ứng multiplex PCR. Tuy nhiên, sau khi phân tích kích thƣớc trên máy giải trình tự chúng tôi chỉ lựa chọn 23 locút microsatellite cho kết quả các đỉnh alen (peak) rõ ràng nhất trên tất cả 530 mẫu bò đƣợc phân tích để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.
Multiplex PCR 1
Multiplex PCR 3
Multiplex PCR 5
Multiplex PCR 6
Hình 3.3: Một số kết quả phân tích kích thƣớc alen của các locút microsatellite trong 6 phản ứng multiplex PCR
3.1.2.2. Tính đa hình của các locút microsatellites
Kết quả phân tích thống kê trên 23 locút microsatellites cho thấy tất cả đều thể hiện tính đa hình cao. Tổng số 205 alen khác nhau đã đƣợc xác định với số lƣợng alen trung bình trên một locút là 8,9 ± 2,05. Trong đó, tính đa hình cao nhất đƣợc thể hiện ở locút HEL9 và ETH225 với 14 alen và tính đa hình thấp nhất đƣợc thấy ở locút INRA035 với 6 alen. Khoảng kích thƣớc alen của các locút đều nằm trong khoảng kích thƣớc đƣợc tổng hợp các kết quả nghiên cứu của Tổ chức Nông lƣơng Thế giới (FAO) và kết quả nghiên cứu ở các giống bò Châu Âu (Bảng 3.1).
3.1.2.3. Tính đa dạng di truyền và cân bằng Hardy-Weinberg
Tính đa dạng di truyền đƣợc đánh giá thông qua giá trị tần số dị hợp tử, giá trị thông tin đa hình, hệ số cận huyết của từng locút và trung bình của toàn bộ các locút. Các kết quả phân tích cho thấy giá trị tần số di hợp tử lý thuyết (Hep) của mỗi locút trong quần thể nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,53 (ở locút ILSTS005) đến 0,85 (ở locút HAUT27). Trung bình tần số dị hợp tử lý thuyết (Hep) và quan sát (Hob) của toàn bộ 23 locút tƣơng ứng là 0,7255 ± 0,1 và 0,6755 ± 0,106. Giá trị thông tin đa hình (PIC) của mỗi locút dao động từ 0,50 đến 0,84, giá trị này ở các locút đều lớn hơn ngƣỡng 0,5 do đó các locút này đều rất phù hợp để nghiên cứu đa dạng di truyền [25].
Hệ số cận huyết của các locút đều thấp, trong đó thể hiện cao nhất ở locút HEL13 (0,142) và thấp nhất ở locút BM1824 (0,026). Hệ số cận huyết trung bình trên toàn bộ 23 locút là 0,063±0,036.
Kết quả kiểm tra tính cân bằng di truyền Hardy Weinberg của từng locút cho thấy hầu hết các locút đều không ở trạng thái cân bằng (p < 0,01), ngoại trừ một số locút: CSSM66, INRA63, BM1824, ILSTS006, HEL9, ETH225, TGL227 (p > 0,01) (Bảng 3.2). Xét trên toàn bộ các locút nghiên cứu thì độ lệch khỏi trạng thái cân bằng Hardy - Weinberg có ý nghĩa thống kê cao ( p<0,01).
Bảng 3.1: Số lƣợng alen và khoảng kích thƣớc alen của các locút microsatellite, nghiên cứu trên 530 mẫu bò nuôi tại tỉnh Hà Giang
Locút microsatellite Số lƣợng alen Khoảng kích thƣớc alen (bp) ở quần thể bò Hà Giang Khoảng kích thƣớc alen (bp) ở các giống bò Châu Âu Khoảng kích thƣớc alen (bp) theo tổng hợp của FAO CSSM66 8 179-197 177-209 171-209 INRA063 8 171-189 167-189 167-189 INRA037 10 116-136 114-148 112-148 INRA005 7 135-147 139-147 135-149 HAUT27 10 128-154 120-158 120-158 TGLA227 10 73-103 75-105 75-105 BM1824 7 178-196 175-193 175-197 ETH3 7 101-127 109-133 103-133 ILSTS006 12 273-303 201-305 277-309 BM1818 8 254-272 248-278 248-278 ETH152 8 191-205 181-211 181-211 HEL9 14 141-169 143-169 141-173 HEL13 8 176-200 178-206 178-200 SPS115 10 242-260 234-274 234-258 TGL126 7 119-131 115-131 115-131 INRA032 9 158-188 166-190 160-204 INRA035 6 102-126 102-124 100-124 ILSTS005 7 178-194 139-147 135-149 BM2113 8 124-142 122-156 122-156 ETH10 7 209-221 207-225 207-231 ETH225 14 139-169 131-203 131-159 TGLA122 12 138-168 136-184 136-184 INRA023 9 195-217 197-225 195-225
Bảng 3.2: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), quan sát (Hob), hệ số cận huyết (Fis) và kết quả kiểm tra từng locút microsatlite với giả thiết không cân bằng di truyền
Hardy-Weinberg Locút microsatellite Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hep) Tần số dị hợp tử quan sát (Hob) Giá trị thông tin đa hình (PIC) Hệ số cận huyết (Fis) CSSM66 0,6829 0,6589 0.638 0,035NS INRA63 0,7176 0,6893 0.672 0,039 * INRA037 0,5973 0,5558 0.567 0,070 * INRA05 0,7979 0,7518 0.769 0,058 * HAUT27 0,8585 0,8167 0.842 0,049NS TGL227 0,6426 0,6093 0.618 0,052NS BM1824 0,6850 0,6673 0.628 0,026NS ETH3 0,5355 0,4811 0.509 0,102 * ILSTS006 0,7948 0,7518 0.769 0,054NS BM1818 0,7698 0,7252 0.742 0,058 * ETH152 0,5498 0,5106 0.532 0,071 * HEL9 0,8566 0,8544 0.841 0,003NS HEL13 0,6881 0,5907 0.633 0,142 * SPS115 0,8177 0,7429 0.794 0,092 * TGL126 0,7110 0,6631 0.673 0,067 * INRA032 0,8042 0,7132 0.781 0,113 * INRA035 0,7748 0,6887 0.740 0,111 * ILSTS005 0,5313 0,4565 0.500 0,141 * BM2113 0,6978 0,6454 0.655 0,075 * ETH10 0,7640 0,7321 0.724 0,042 * ETH225 0,8413 0,8046 0.822 0,044NS TGL122 0,8113 0,7874 0.786 0,030 * INRA023 0,7555 0,7310 0.722 0,032 * Trung bình 0,7255 ± 0,1 0,6755 ± 0,1 0.693 0,063 ± 0,036 *
: Không cân bằng di truyền Hardy- Weinberg với ý nghĩa p<0,01, NS: không có ý nghĩa.
Nhƣ vậy, xét trên phƣơng diện tổng thể thì quần thể bò nuôi ở Hà Giang không cân bằng di truyền theo Hardy-Weinberg. Điều này hoàn toàn hợp lý bởi trên thực tế hầu hất các quần thể trong tự nhiên đều khó có thể duy trì ở trạng thái cân bằng do chúng luôn luôn bị tác động bởi các điều kiện ngoại cảnh. Theo Nei (1978) [102], các nguyên nhân có thể dẫn đến quần thể mất cân bằng di truyền nhƣ: đột biến, lạc dòng di truyền, giao phối cận huyết, chọn lọc các tính trạng kinh tế liên kết với locút nghiên cứu và do cách ly địa lý (isolate by distance). Do tỉnh Hà Giang là một vùng có điều kiện địa lý đồi núi và giao thông khó khăn bởi vậy chúng tôi cho rằng, một trong những nguyên nhân chính dẫn đến mất cân bằng di truyền ở quần thể bò tại tỉnh Hà Giang có thể do sự cách ly bởi địa lý dẫn đến sự hình thành các nhóm khác nhau về di truyền.
So sánh với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới đã công bố thì tính đa dạng di truyền của quần thể bò nuôi ở Hà Giang tƣơng đƣơng với các giống bò của Trung Quốc và vùng Cận Đông, cao hơn các giống bò của Châu Âu (Bảng 3.3). Nguyên nhân của sự khác nhau về tính đa dạng di truyền giữa quần thể bò ở Hà Giang với các giống bò của Châu Âu là do tập quán chăn nuôi ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng núi cao nhƣ Hà Giang với nhiều dân tộc cùng sinh sống, chăn thả tự nhiên, không có sự chọn lọc và sự trao đổi mua bán bò giữa ngƣời dân xảy ra thƣờng xuyên. Đây là những đặc điểm chung của hệ thống chăn nuôi tại các nƣớc đang phát triển. Trong khi đó, các giống bò ở châu Âu đƣợc chọn lọc theo từng tính trạng, nuôi tập trung trong trang trại và thƣờng sử dụng phƣơng pháp thụ tinh nhân tạo trong quá trình nhân giống.
Bảng 3.3: So sánh tính đa dạng di truyền của bò nuôi ở Hà Giang với một số kết quả nghiên cứu trên các quần thể bò khác
Tác giả Đối tƣợng nghiên cứu Trung bình số alen/locút
Tần số dị hợp tử Martin-Buriel và
cộng sự (1999)
6 giống bò nội của Tây
Ban Nha 8,6 0,56 - 0,68
Mukesh và cộng
sự (2004) 3 giống bò nội của Ấn Độ 5,2 - 6,5 0,61 - 0,7 Brenneman và cộng sự (2006) 4 giống bò: Angus, American Brahman, Senepol, Romosinuano 5,1 - 8,7 0.70 Moazami-
Goudarzi (1997) 10 giống bò Châu Âu 6,0 - 7,7 0,53 - 0,66 Loftus và cộng sự (1999) Giống bò ở vùng Cận đông 7 - 8,8 0,74 - 0,79 (Iraq) Canon và cộng sự (2001)
18 giống bò thịt của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha,
Pháp
5,5 - 7,1 0.63 - 0,70
Schemid và cộng sự (1999)
5 giống bò của Thuỵ Sỹ
4,7 – 6,5 0,60 – 0,69
Kim và cộng sự (2002)
3 quần thể bò của Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản Trung bình ở cả 3 quần thể là 9,7 TQ (0,74) HQ (0,72)