Quy trình tách chiết ADN từ các mẫu máu và mô đƣợc thực hiện theo quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất bộ kít tách ADN của hãng Qiagen (Đức). Nồng độ và độ sạch của các mẫu ADN sau khi tách chiết đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và trên máy đo quang phổ hấp thụ. Chúng tôi chỉ sử dụng các mẫu ADN có chất lƣợng và nồng độ tốt để thực hiện các phép phân tích di truyền tiếp theo.
Hình 2.1: Vị trí các địa điểm thu mẫu sinh học quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang
2.2.1.3. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền sử dụng kỹ thuật microsatellite Nhân ADN đặc hiệu (PCR) các locút microsatellite
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 30 locút microsatellites theo khuyến cáo của tổ chức Nông lƣơng Thế giới và Hội di truyền động vật Quốc tế (FAO-ISAG) dùng để đánh giá các đặc điểm di truyền của quần thể động vật nuôi (http:// www.fao.org/dat_is).
Một mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc trong mỗi cặp mồi sử dụng để nhân PCR các locút microsatellite đƣợc đánh dấu huỳnh quang theo các nhóm D2, D3 và D4 ở đầu 5’ dùng cho máy giải trình tự của hãng Beckman Coulter - Mỹ. Ba mƣơi cặp mồi này đƣợc chuẩn hóa trong 6 phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR). Danh sách các cặp mồi microsatellite và các multiplex PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Một số thông tin về 30 cặp mồi microsatellite Multiplex
PCR
Tên locút Nhiệt độ gắn mồi (0 C) Chất đánh dấu Màu Khoảng kích thƣớc alen (bp) MPX1 CSRM 60 55-65 D2 Đen 79 -115 CSSM 66 55-65 D2 Đen 171-209 HEL 1 54-57 D3 Xanh lục 99-119 INRA 063 55-58 D3 Xanh lục 167-189 INRA 037 57-58 D4 Xanh sẫm 112-148 MPX2 INRA 005 55 D2 Đen 135-149 HAUT 27 57 D3 Xanh lục 120-158 TGLA 227 55-56 D4 Xanh sẫm 75-105 BM 1824 55-60 D4 Xanh sẫm 176-197 MPX3 ETH 3 55-65 D2 Đen 103-133 ILSTS 006 55 D2 Đen 277-309 BM 1818 56-60 D3 Xanh lục 248-278 TGLA 53 55 D3 Xanh lục 143-191 ETH 152 55-60 D4 Xanh sẫm 181-211 HEL 9 52-57 D4 Xanh sẫm 141-173 MPX4 HEL 5 52-57 D2 Đen 145-171 HEL 13 52-57 D2 Đen 178-200 HAUT 24 52-55 D3 Xanh lục 104-158 SPS 115 55-60 D3 Xanh lục 234-258 TGLA 126 55-58 D4 Xanh sẫm 115-131 INRA 032 55-58 D4 Xanh sẫm 160-204 MPX5 INRA 035 55-60 D2 Đen 100-124 ILSTS 005 54-58 D2 Đen 176-194 MM 112 50-55 D4 Xanh sẫm 101-145 ETH 185 58-67 D4 Xanh sẫm 214-246 MPX6 BM 2113 55-60 D2 Đen 122-156 ETH 10 55-65 D2 Đen 207-231 ETH 225 55-65 D3 Xanh lục 131-159 TGLA 122 55-58 D4 Xanh sẫm 136-184 INRA 023 55 D4 Xanh sẫm 195-225
Phản ứng nhân gen PCR đối với mỗi multiplex PCR đƣợc thực hiện trong tổng thể tích 25 l gồm có: đệm PCR 1x (200mM Tris-HCl pH 8,3; 200mM KCl, 50mM (NH4)2SO4), 200 M mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 10 pM mồi không đánh dấu và đánh dấu huỳnh quang, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas). Phản ứng multiplex-PCR đƣợc thực hiện theo điều kiện sau: giai đoạn tiền biến tính ở 950
C trong 4 phút, 35 chu kỳ tiếp theo (biến tính 950
C trong 1 phút, gắn mồi 550C trong 1 phút, tổng hợp kéo dài chuỗi 68 – 720
C trong 1 phút 20 giây), cuối cùng kết thúc ở 720
C trong 10 phút.
Phân tích đa hình alen các locút microsatellite
Một microlite của tất cả các sản phẩm multiplex-PCR dƣơng tính sau khi bổ sung 25 l đệm SLS (Sample Loading Solution Beckman Coulter) và 0,15 l ADN thang chuẩn (DNA Size standard Beckman Coulter) đƣợc tiến hành phân tách bằng hệ thống điện di mao quản trên máy giải trình tự CEQ8000 của hãng Beckman Coulter. Kích thƣớc các alen đƣợc phân tích tự động bằng phần mềm Genetics analysis system của máy giải trình tự CEQ8000 (phiên bản 9.0).
2.2.1.4. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể Nhân ADN đặc hiệu (PCR) vùng D-loop
Vùng ADN D-loop ty thể có kích thƣớc 990 bp đƣợc tiến hành nhân bản bởi phản ứng PCR trên 26 mẫu bò thuộc các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Xín Mần và Hoàng Su Phì của tỉnh Hà Giang. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng để nhân bản vùng D- loop ở bò do chúng tôi thiết kế có trình tự nhƣ sau:
Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’
Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 50µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngƣợc, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas) và 50-100 ng ADN khuôn. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55o
C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72o
C trong 10 phút.
Giải trình tự ADN vùng D-loop
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng bộ kít tinh sạch (QIAquick PCR Purification kit) của hãng Qiagen (Đức).
Phản ứng giải trình tự đƣợc thực hiện trực tiếp từ các sản phẩm PCR sau khi đã đƣợc tinh sạch với cả 2 mồi xuôi và ngƣợc, sử dụng bộ kít giải trình tự (DTCS- Quick Start Master Mix) của hãng Beckman Coulter-Mỹ. Trình tự các nucleotide đƣợc tiến hành xác định trên máy giải trình tự CEQ8000.
Phân tích trình tự
Trình tự nucleotide vùng D-loop ty thể của 26 mẫu bò tại Hà Giang đƣợc so sánh với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)
của các mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bò rừng Mỹ (Bos binson) và trình tự toàn bộ ADN ty thể của hai mẫu bò không có u (Bos taurus) và có u (Bos indicus) đối chứng có mã truy cập trên ngân hàng gen tƣơng ứng là V00654 và NC-005971 sử dụng công cụ CLUSTALW của phần mềm BIOEDIT phiên bản 5.0.9 (Hall, 2001) [48] và DNAsp phiên bản 4.0 (Rozas và cộng sự, 2003) [113].
Khoảng cách di truyền dựa trên sự sai khác trình tự vùng D-loop ty thể giữa các quần thể bò đƣợc tính theo phƣơng pháp của Tamura và Nei (1993) [127]. Cây phân loại (phylogenetic tree) thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các cá thể bò đƣợc xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 4.0 (Tamura và cộng sự, 2007) [126].
2.2.1.5. Phương pháp phân tích thống kê di truyền
Ước lượng một số chỉ số liên quan đến tính đa dạng di truyền
Số lƣợng alen của mỗi locút và trung bình số alen trên mỗi locút của toàn bộ quần thể đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix phiên bản 4.0.5.2. (Belkhir và công sự 2004) [17].
Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hep), dị hợp tử quan sát (Hob) đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Hệ số sai khác di truyền (FST) theo Weir (1984) [140] và khoảng cách di truyền (Ds) theo Nei (1972) [102] giữa các quần thể bò phân bố ở các huyện đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Hệ số cận huyết (Fis) của từng locút và trung bình của toàn bộ các locút trên quần thể đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Giá trị thông tin đa hình (PIC) của mỗi locút đƣợc tính theo Botstein và cộng sự (1980) [25].
Bảng 2.2: Công thức tính một số giá trị thống kê của quần thể
Chỉ số Công thức tính
Tần số alen của locút
2N A 2 k 1 j j i i i i A A A p
Trong đó: pilà tần số của alen i ; AiAi, AiAj tƣơng ứng là số cá thể mang đồng hợp tử và dị hợp tử với alen i; k là số lƣợng alen của locút ; N là số lƣợng cá thể
Tần số dị hợp tử lý thuyết (mong đợi)
1 2 1 2 1 2 N p N H k i i ep
Trong đó: Hep là tần số dị hợp tử lý thuyết của một locút;
pi là tần số của alen i; k là số lƣợng alen của locút; N là số lƣợng cá thể.
Giá trị thông tin đa hình (PIC) của mỗi locút 1 1 1 2 2 1 2 2 1 k i k i j j i k i i p p p PIC
Trong đó: pi, pj là tần số của alen i và j; k là số lƣợng alen của mỗi locút
Hệ số sai khác di truyền FST = T ep S ep T ep H H H , , ,
Trong đó: Hep,T là tần số dị hợp tử lý thuyết của tổng quần thể; Hep,S là tần số dị hợp tử của quần thể nhỏ (subpopulation) phân bố ở các huyện
Hệ số cận huyết
Fis =
Hep Hob Hep
Trong đó: Hep là tần số di hợp tử lý thuyết; Hob là tần số di hợp tử quan sát. Khoảng cách di truyền (Ds) Nei (1972) L i K j L i k j L i K j ijy P ijx P PijxPijy Ds 1 1 1 1 2 2 1 1 ln
Trong đó: Pijx, Pijy là tần số alen j tại locút i ở nhóm bò x và y tƣơng ứng; K là số alen tại locút i; L là số locút
Kiểm tra tính cân bằng di truyền Hardy-Weinberg
Độ phù hợp với cân bằng di truyền theo Hardy-Weinberg của từng locút và toàn bộ các locút trên quần thể đƣợc kiểm tra bằng phép thử “khi bình phƣơng” (χ2
), so sánh giữa tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử theo lý thuyết của từng locút đƣợc tính theo công thức:
χ2 = Hep Hep Hob )2 (
Trong đó: Hob là tần số di hợp tử quan sát; Hep là tần sô dị hợp tử theo lý thuyết.
Giá trị χ2
càng nhỏ thì mức độ phù hợp càng cao, ngƣợc lại mức độ sai lệch giữa hai số liệu trên là bằng chứng cho thấy không cân bằng theo Hardy-Weinberg. Phép kiểm tra này đƣợc thực hiện bởi phần mềm Genetix và GENEPOP phiên bản 3.4 (Raymond và Rousset, 2004) [110].
Kiểm tra mối tương quan giữa khoảng cách di truyền với khoảng cách địa lý
Để tiến hành phép kiểm tra này, trƣớc tiên tiến hành thiết lập một ma trận thể hiện khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý giữa các nhòm bò phân bố trên 28 xã nghiên cứu.
Trong đó một nửa ma trận thể hiện mối quan hệ về khoảng cách di truyền giữa các nhóm bò ở 28 xã, một nửa khác thể hiện mối quan hệ về khoảng cách địa lý giữa 28 xã. Khoảng cách địa lý giữa các xã đƣợc tính dựa trên vị trí địa lý đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định vị toàn cầu (GPS) của từng xã.
Sau đó sử dụng phép thử Mantel (Mantel test) của phần mềm Genetix để kiểm tra mối tƣơng quan này. Nếu kết quả phép kiểm tra có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 thì có nghĩa là có sự tƣơng quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý. Ngƣợc lai nếu p > 0,05 nghĩa là không có sự tƣơng quan giữa hai yếu tố này (Mantel, 1967) [86].
Xác định cấu trúc di truyền quần thể
Phần mềm SRTUCTURE phiên bản 2.2 (Pritchard và cộng sự, 2000) [109] đƣợc sử dụng để xác định các nhóm (quần thể phụ) cá thể khác nhau về di truyền. Thuật toán của phần mềm là phƣơng pháp phân tích nhóm dựa trên mô hình xác định các nhóm có tần số alen khác biệt. Trƣớc tiên thuật toán giả thiết một mô hình có số nhóm là K (trong đó K có thể chƣa biết trƣớc và đƣợc giả thiết bởi ngƣời sử dụng) trong đó mỗi nhóm K đƣợc mô tả bởi một tập hợp tần số alen của từng locút. Sau đó thuật toán sẽ tiến hành chỉ định các cá thể vào các nhóm trên cơ sở kiểu gen của toàn bộ các locút nghiên cứu. Số nhóm (K) đƣợc xác định bằng cách sử dụng phƣơng pháp tính xác suất a priori. Ngoài ra số nhóm K còn đƣợc xác định dựa trên sự tƣơng đồng của giá trị xác suất của các lần chạy lặp lại tại mỗi giá trị K. Kết quả của phép phân tích đƣợc thể hiện ở dạng số và dạng đồ hoạ, trong đó ở dạng số sẽ thể hiện tỷ lệ hệ gen của từng cá thể hoặc quần thể có mối quan hệ ở mỗi nhóm đƣợc đƣa ra tƣơng ứng với giá trị K.
Để áp dụng mô hình này để phân tích cấu trúc di truyền quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang, trƣớc tiên chúng tôi giả thiết bò ở Hà Giang có thể đƣợc phân thành 10 nhóm (K = 10). Tại mỗi giá trị K đƣợc tiến hành chạy lặp lại 10 lần, sau đó phân tích kết quả xác suất tại mỗi giá trị K. Tại giá trị K nào có xác suất [LnPr(X/K)] lớn nhất và ổn định nhất giữa các lần chạy lặp lại sẽ đƣợc lựa chọn là kết quả của phép phân tích.
Xây dựng cây phân loại di truyền (phylogenetic tree)
Cây phân loại (cây khoảng cách) là sự thể hiện đồ hoạ hay là bản đồ của ma trận khoảng cách di truyền giữa các cá thể, quần thể...Có một số phƣơng pháp xây dựng cây khoảng cách di truyên khác nhau, tuy nhiên hai phƣơng pháp đƣợc biết đến nhiều nhất đó là UPGMA (Unweighted Paired Group Method of Arithmetic Average) và NJ (Neighbor – Joining Method). Trong đó phƣơng pháp NJ thƣờng đƣợc sử dụng cho các cá thể hay quần thể có mối quan hệ di truyền gần gũi.
Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò phân bố ở 8 huyện dựa trên sự phân bố tần số alen của các locút microsatellite theo phƣơng pháp NJ đƣợc thực hiện bởi phần mềm POPULATION và TREEVIEW.
Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền của quần thể bò ở Hà Giang với một số quần thể bò khác dựa trên sự sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp NJ bằng phần mềm MEGA4.
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu đối với quần thể bò hoang dã
2.2.2.1. Thu thập mẫu
Tổng cộng 555 mẫu phân và 1 mẫu da bò hoang dã ở Việt Nam đƣợc chúng tôi thu thập tại một số vƣờn Quốc gia và khu bảo tồn nhƣ: vƣờn Quốc Gia Bù Gia Mập, Vƣờn Quốc Gia Cát Tiên, Vƣờn Quốc Gia Yok Đôn, Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình, khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô, khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai và mẫu phân bò tót (Bos gaurus) tại Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh. Các mẫu phân này đƣợc bảo quản trong cồn 100% (ethanol) và trong dung dịch bảo quản RNA later của hãng Qiagen (Đức). Trong quá trình đi khảo sát và thu thập các mẫu phân ngoài thực địa, chúng tôi chỉ thu các mẫu phân còn tƣơi, ƣớc lƣợng thời gian từ khi con vật thải ra đến khi đƣợc thu thập vảo khoảng 1-5 ngày. Địa điểm thu thập mẫu phân thƣờng tập trung vào các khu vực đất có muối khoáng, trảng cỏ và gần nguồn nƣớc vì những nơi này bò hoang thƣờng tập trung nhiều nhất. Ngoại trừ mẫu phân tại Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh là biết rõ nguồn gốc về loài, các mẫu phân bò hoang còn lại đều không biết nguồn gốc chúng thuộc bó tót (Bos gaurus), bò rừng (Bos javanicus), bò xám (Bos souveli) hay bò nuôi (Bos indicus và Bos taurus).
Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành thu thập và phân tích di truyền của 11 mẫu bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus) của các quốc gia khác nhƣ Campuchia, Lào và Ấn độ đƣợc nuôi giữ tại một số vƣờn thú trên thế giới nhƣ: vƣờn thú Pari Cộng hoà Pháp (bò tót), vƣờn thú Maldrid- Tây Ban Nha (bò tót),
vƣờn thú Copenhagen- Đan Mạch (bò tót) và khu bảo tồn động vật hoang dã Phnom Tamao – Campuchia (bò tót và bò rừng) (Bảng 2.3).
Bảng 2.3: Địa điểm thu thập các mẫu sinh học của bò hoang dã
Địa điểm thu mẫu Loại mẫu Số lƣợng mẫu
Vƣờn quốc gia Cát Tiên-Đồng Nai Phân 520
Vƣờn quốc gia Bù Gia Mập-Bình Phƣớc Phân 8
Khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô-Đăk Lăk Phân 20
Vƣờn Quốc Gia Yok Đôn-Dăk Lăk Phân 4
Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình
Phân 2
Khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai-Phú Yên Da đầu 1 Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh Phân bò tót 1
Vƣờn thú Pari - Cộng hoà Pháp Máu bò tót 2
Vƣờn thú Madrid -Tây Ban Nha Phân bò tót 4
Vƣờn thú Copenhagen - Đan Mạch Máu bò tót 2
Khu bảo tồn động vật hoang dã - Campuchia Máu bò tót (2) Máu bò rừng (1)
3
2.2.2.2. Tách chiết ADN từ mẫu phân
Quy trình tách chiết ADN từ các mẫu phân đƣợc chúng tôi sử dụng và cải tiến từ quy trình của bộ kít tách QIAamp DNA Stool Mini Kit của hãng Qiagen (Đức).