Do khó khăn trong việc tiếp cận trực tiếp để thu thập các mẫu sinh học (máu, mô) phục vụ nghiên cứu di truyền, vì vậy hầu hết các nghiên cứu về 2 loài bò tót và bò rừng hoang dã ở các nƣớc có sự phân bố tự nhiên chủ yếu đƣợc thực hiện ở mức độ sinh thái học với mục đích điều tra, đánh giá sự phân bố và hiện trạng của quần thể (Srikosamatara và cộng sự, 1995; Steinmetz và cộng sự, 2004 ; Prayurasiddhi, 1997; Soriyun, 2001; Đặng Huy Huỳnh, 1986; Lê Vũ Khôi, 1995; Nguyễn Mạnh Hà, 2008) [121], [122], [108], [120], [7], [72]
Trên thế giới mới chỉ có một số ít các nghiên cứu về di truyền ở bò tót và bò rừng đƣợc thực hiện trong vòng 10 năm trở lại đây. Ở mức độ di truyền tế bào, các nghiên cứu của Gallagher và cộng sự, (1999); Vadhanakul và cộng sự, (2003); Bong So và cộng sự, (1988) [44], [133], [23] đƣợc thực hiện nhằm nghiên cứu đặc điểm và số lƣợng bộ nhiễm sắc thể ở một số loài phụ của bò tót và bò rừng. Ở mức độ di truyền phân tử, các nghiên cứu của Ritz và cộng sự; (2000); Verkaar và cộng sự, (2000); Hassanin và cộng sự, (2007) [111], [135], [50] đƣợc thực hiện với mục đích nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phát sinh của 2 loài này với loài bò nuôi và các loài hoang dã khác. Mặc dù ở những nghiên cứu về quan hệ nguồn gốc phát sinh các tác giả đã sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử nhƣ microsatellite, phân tích ADN hệ gen ty thể nhƣng chỉ đƣợc thực hiện với số lƣợng nhỏ ở các mẫu nuôi nhốt hoặc từ các mẫu tiêu bản (xƣơng, da) của con vật đã chết. Do đó, các nghiên cứu này chƣa đƣa ra đƣợc những kết quả về đặc điểm di truyền của quần thể đặc biệt là các quần thể hoang dã đang tồn tại.
Gần đây có 2 công trình nghiên cứu rất có giá trị về di truyền của quần thể bò tót và quần thể bò rừng đƣợc thực hiện trên các mẫu vật sống đó là: (i) Vidya và Sukumar (2006) tiến hành phân tích trình tự ADN vùng D-loop ty thể và đã xác định đƣợc 6 kiểu haplotype ở quần thể bò tót phía nam Ấn Độ. Các kiểu haplotype này đã đƣợc các tác giả đƣa lên ngân hàng gen (Genebank) với các mã truy cập là: DQ377056, DQ377057, DQ377058, DQ377059, DQ377060, DQ377061
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/87133222). Tuy vậy, những kết quả chi tiết về di truyền của quần thể bò tót vẫn chƣa đƣợc các tác giả đăng tải trên các tạp chí khoa học; (ii) Bradshaw và cộng sự (2007) [27] đã sử dụng 12 microsatellite ở bò nuôi để đánh giá tính đa dạng di truyền của quần thể bò rừng đƣợc bảo tồn ở vƣờn Quốc gia Garig Gunak Barlu của Öc, quần thể bò rừng này có nguồn gốc từ Indonesia đƣợc đƣa vào Öc năm 1849. Trong đó, các tác giả đã chỉ ra tính đa dạng di truyền của quần thể này là rất thấp.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về di truyền của 2 loài bò tót và bò rừng hoang dã còn rất hiếm. Mới chỉ có một công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trung Thành và cộng sự (2007) [104] sử dụng kỹ thuật microsatellite để nghiên cứu di truyền ở bò tót. Mục đích của các tác giả là khảo sát tính bảo thủ của các locút microsatellite của bò nuôi ở hệ gen bò tót hoang dã đồng thời các tác giả cũng bƣớc đầu phân tích và nhận định tính đa dạng di truyền rất thấp ở quần thể bò tót ở Việt Nam. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này các tác giả mới chỉ thực hiện trên một số lƣợng mẫu còn ít (11 mẫu) và từ các mẫu vật của bò tót đã chết (xƣơng, da...) do vậy kết quả đánh giá tính đa dạng di truyền chƣa mang tính đại diện và có giá trị trong công tác định hƣớng bảo tồn tiếp theo. Trong khi đó, chƣa có một công trình nghiên cứu nào đƣợc thực hiện trên bò rừng.
Vì vậy, công trình này của chúng tôi là công trình đầu tiên áp dụng các kỹ thuật di truyền phân tử hiện đại để nghiên cứu di truyền quần thể bò tót và bò rừng đang tồn tại ở Việt Nam từ các mẫu phân sinh học đƣợc thu thập bằng cách gián tiếp không gây hại tới con vật (non-invasive sampling).
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu của đề tài là quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang và bò hoang dã ở Việt Nam đƣợc thu thập tại vƣờn Quốc gia Cát Tiên - Đồng Nai, vƣờn Quốc gia Bù Gia Mập – Bình Phƣớc, vƣờn Quốc gia Yok Đôn – Đăk Lăk, Khu bảo tồn thiên nhiên Krông Trai – Phú Yên, Khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô – Đăk Lăk, Thảo cầm viên Thành Phố Hồ Chí Minh.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu đối với quần thể bò nuôi tại Hà Giang
2.2.1.1. Thu thập mẫu
Tổng số 530 mẫu máu và mô tai bò (218 đực và 312 cái) không có quan hệ huyết thống đƣợc thu thập trên 28 xã thuộc 8 huyện của tỉnh Hà Giang (Đồng Văn, Mèo Vạc, Yên Minh, Quản Bạ, Hoàng Su Phì, Xín Mần, Bắc Mê và Quang Bình). Vị trí các địa điểm thu thập mẫu đƣợc trình bày ở hình 2.1. Để tránh khả năng các mẫu có quan hệ huyết thống, chúng tôi đã tiến hành phỏng vấn các hộ dân về nguồn gốc của vật nuôi và mối quan hệ của từng cá thể đƣợc nuôi trong đàn.
Các mẫu máu sau lấy đƣợc bảo quản trong dung dịch chống đông máu EDTA 0,5M, các mẫu mô đƣợc bảo quản trong dung dịch cồn 100%.
2.2.1.2. Tách chiết ADN
Quy trình tách chiết ADN từ các mẫu máu và mô đƣợc thực hiện theo quy trình khuyến cáo của nhà sản xuất bộ kít tách ADN của hãng Qiagen (Đức). Nồng độ và độ sạch của các mẫu ADN sau khi tách chiết đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và trên máy đo quang phổ hấp thụ. Chúng tôi chỉ sử dụng các mẫu ADN có chất lƣợng và nồng độ tốt để thực hiện các phép phân tích di truyền tiếp theo.
Hình 2.1: Vị trí các địa điểm thu mẫu sinh học quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang
2.2.1.3. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền sử dụng kỹ thuật microsatellite Nhân ADN đặc hiệu (PCR) các locút microsatellite
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 30 locút microsatellites theo khuyến cáo của tổ chức Nông lƣơng Thế giới và Hội di truyền động vật Quốc tế (FAO-ISAG) dùng để đánh giá các đặc điểm di truyền của quần thể động vật nuôi (http:// www.fao.org/dat_is).
Một mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc trong mỗi cặp mồi sử dụng để nhân PCR các locút microsatellite đƣợc đánh dấu huỳnh quang theo các nhóm D2, D3 và D4 ở đầu 5’ dùng cho máy giải trình tự của hãng Beckman Coulter - Mỹ. Ba mƣơi cặp mồi này đƣợc chuẩn hóa trong 6 phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR). Danh sách các cặp mồi microsatellite và các multiplex PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Một số thông tin về 30 cặp mồi microsatellite Multiplex
PCR
Tên locút Nhiệt độ gắn mồi (0 C) Chất đánh dấu Màu Khoảng kích thƣớc alen (bp) MPX1 CSRM 60 55-65 D2 Đen 79 -115 CSSM 66 55-65 D2 Đen 171-209 HEL 1 54-57 D3 Xanh lục 99-119 INRA 063 55-58 D3 Xanh lục 167-189 INRA 037 57-58 D4 Xanh sẫm 112-148 MPX2 INRA 005 55 D2 Đen 135-149 HAUT 27 57 D3 Xanh lục 120-158 TGLA 227 55-56 D4 Xanh sẫm 75-105 BM 1824 55-60 D4 Xanh sẫm 176-197 MPX3 ETH 3 55-65 D2 Đen 103-133 ILSTS 006 55 D2 Đen 277-309 BM 1818 56-60 D3 Xanh lục 248-278 TGLA 53 55 D3 Xanh lục 143-191 ETH 152 55-60 D4 Xanh sẫm 181-211 HEL 9 52-57 D4 Xanh sẫm 141-173 MPX4 HEL 5 52-57 D2 Đen 145-171 HEL 13 52-57 D2 Đen 178-200 HAUT 24 52-55 D3 Xanh lục 104-158 SPS 115 55-60 D3 Xanh lục 234-258 TGLA 126 55-58 D4 Xanh sẫm 115-131 INRA 032 55-58 D4 Xanh sẫm 160-204 MPX5 INRA 035 55-60 D2 Đen 100-124 ILSTS 005 54-58 D2 Đen 176-194 MM 112 50-55 D4 Xanh sẫm 101-145 ETH 185 58-67 D4 Xanh sẫm 214-246 MPX6 BM 2113 55-60 D2 Đen 122-156 ETH 10 55-65 D2 Đen 207-231 ETH 225 55-65 D3 Xanh lục 131-159 TGLA 122 55-58 D4 Xanh sẫm 136-184 INRA 023 55 D4 Xanh sẫm 195-225
Phản ứng nhân gen PCR đối với mỗi multiplex PCR đƣợc thực hiện trong tổng thể tích 25 l gồm có: đệm PCR 1x (200mM Tris-HCl pH 8,3; 200mM KCl, 50mM (NH4)2SO4), 200 M mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 10 pM mồi không đánh dấu và đánh dấu huỳnh quang, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas). Phản ứng multiplex-PCR đƣợc thực hiện theo điều kiện sau: giai đoạn tiền biến tính ở 950
C trong 4 phút, 35 chu kỳ tiếp theo (biến tính 950
C trong 1 phút, gắn mồi 550C trong 1 phút, tổng hợp kéo dài chuỗi 68 – 720
C trong 1 phút 20 giây), cuối cùng kết thúc ở 720
C trong 10 phút.
Phân tích đa hình alen các locút microsatellite
Một microlite của tất cả các sản phẩm multiplex-PCR dƣơng tính sau khi bổ sung 25 l đệm SLS (Sample Loading Solution Beckman Coulter) và 0,15 l ADN thang chuẩn (DNA Size standard Beckman Coulter) đƣợc tiến hành phân tách bằng hệ thống điện di mao quản trên máy giải trình tự CEQ8000 của hãng Beckman Coulter. Kích thƣớc các alen đƣợc phân tích tự động bằng phần mềm Genetics analysis system của máy giải trình tự CEQ8000 (phiên bản 9.0).
2.2.1.4. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể Nhân ADN đặc hiệu (PCR) vùng D-loop
Vùng ADN D-loop ty thể có kích thƣớc 990 bp đƣợc tiến hành nhân bản bởi phản ứng PCR trên 26 mẫu bò thuộc các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Xín Mần và Hoàng Su Phì của tỉnh Hà Giang. Cặp mồi đặc hiệu sử dụng để nhân bản vùng D- loop ở bò do chúng tôi thiết kế có trình tự nhƣ sau:
Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’
Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tích 50µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngƣợc, 1,5 Unit enzym Hot Sart Taq DNA Polymerase (Fermentas) và 50-100 ng ADN khuôn. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo các bƣớc: Trƣớc tiên ADN đƣợc biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo đó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ đƣợc thực hiện ở điều kiện nhƣ sau: biến tính ở 92oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55o
C trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72o
C trong 10 phút.
Giải trình tự ADN vùng D-loop
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng bộ kít tinh sạch (QIAquick PCR Purification kit) của hãng Qiagen (Đức).
Phản ứng giải trình tự đƣợc thực hiện trực tiếp từ các sản phẩm PCR sau khi đã đƣợc tinh sạch với cả 2 mồi xuôi và ngƣợc, sử dụng bộ kít giải trình tự (DTCS- Quick Start Master Mix) của hãng Beckman Coulter-Mỹ. Trình tự các nucleotide đƣợc tiến hành xác định trên máy giải trình tự CEQ8000.
Phân tích trình tự
Trình tự nucleotide vùng D-loop ty thể của 26 mẫu bò tại Hà Giang đƣợc so sánh với trình tự có sẵn trên ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)
của các mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bò rừng Mỹ (Bos binson) và trình tự toàn bộ ADN ty thể của hai mẫu bò không có u (Bos taurus) và có u (Bos indicus) đối chứng có mã truy cập trên ngân hàng gen tƣơng ứng là V00654 và NC-005971 sử dụng công cụ CLUSTALW của phần mềm BIOEDIT phiên bản 5.0.9 (Hall, 2001) [48] và DNAsp phiên bản 4.0 (Rozas và cộng sự, 2003) [113].
Khoảng cách di truyền dựa trên sự sai khác trình tự vùng D-loop ty thể giữa các quần thể bò đƣợc tính theo phƣơng pháp của Tamura và Nei (1993) [127]. Cây phân loại (phylogenetic tree) thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các cá thể bò đƣợc xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 4.0 (Tamura và cộng sự, 2007) [126].
2.2.1.5. Phương pháp phân tích thống kê di truyền
Ước lượng một số chỉ số liên quan đến tính đa dạng di truyền
Số lƣợng alen của mỗi locút và trung bình số alen trên mỗi locút của toàn bộ quần thể đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix phiên bản 4.0.5.2. (Belkhir và công sự 2004) [17].
Tần số dị hợp tử lý thuyết (Hep), dị hợp tử quan sát (Hob) đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Hệ số sai khác di truyền (FST) theo Weir (1984) [140] và khoảng cách di truyền (Ds) theo Nei (1972) [102] giữa các quần thể bò phân bố ở các huyện đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Hệ số cận huyết (Fis) của từng locút và trung bình của toàn bộ các locút trên quần thể đƣợc ƣớc lƣợng bằng phần mềm Genetix (phiên bản 4.0.5.2).
Giá trị thông tin đa hình (PIC) của mỗi locút đƣợc tính theo Botstein và cộng sự (1980) [25].
Bảng 2.2: Công thức tính một số giá trị thống kê của quần thể
Chỉ số Công thức tính
Tần số alen của locút
2N A 2 k 1 j j i i i i A A A p
Trong đó: pilà tần số của alen i ; AiAi, AiAj tƣơng ứng là số cá thể mang đồng hợp tử và dị hợp tử với alen i; k là số lƣợng alen của locút ; N là số lƣợng cá thể
Tần số dị hợp tử lý thuyết (mong đợi)
1 2 1 2 1 2 N p N H k i i ep
Trong đó: Hep là tần số dị hợp tử lý thuyết của một locút;
pi là tần số của alen i; k là số lƣợng alen của locút; N là số lƣợng cá thể.
Giá trị thông tin đa hình (PIC) của mỗi locút 1 1 1 2 2 1 2 2 1 k i k i j j i k i i p p p PIC
Trong đó: pi, pj là tần số của alen i và j; k là số lƣợng alen của mỗi locút
Hệ số sai khác di truyền FST = T ep S ep T ep H H H , , ,
Trong đó: Hep,T là tần số dị hợp tử lý thuyết của tổng quần thể; Hep,S là tần số dị hợp tử của quần thể nhỏ (subpopulation) phân bố ở các huyện
Hệ số cận huyết
Fis =
Hep Hob Hep
Trong đó: Hep là tần số di hợp tử lý thuyết; Hob là tần số di hợp tử quan sát. Khoảng cách di truyền (Ds) Nei (1972) L i K j L i k j L i K j ijy P ijx P PijxPijy Ds 1 1 1 1 2 2 1 1 ln
Trong đó: Pijx, Pijy là tần số alen j tại locút i ở nhóm bò x và y tƣơng ứng; K là số alen tại locút i; L là số locút
Kiểm tra tính cân bằng di truyền Hardy-Weinberg
Độ phù hợp với cân bằng di truyền theo Hardy-Weinberg của từng locút và toàn bộ các locút trên quần thể đƣợc kiểm tra bằng phép thử “khi bình phƣơng” (χ2
), so sánh giữa tần số dị hợp tử quan sát và tần số dị hợp tử theo lý thuyết của từng locút đƣợc tính theo công thức:
χ2 = Hep Hep Hob )2 (
Trong đó: Hob là tần số di hợp tử quan sát; Hep là tần sô dị hợp tử theo lý thuyết.
Giá trị χ2
càng nhỏ thì mức độ phù hợp càng cao, ngƣợc lại mức độ sai lệch giữa hai số liệu trên là bằng chứng cho thấy không cân bằng theo Hardy-Weinberg. Phép kiểm tra này đƣợc thực hiện bởi phần mềm Genetix và GENEPOP phiên bản 3.4 (Raymond và Rousset, 2004) [110].
Kiểm tra mối tương quan giữa khoảng cách di truyền với khoảng cách địa lý
Để tiến hành phép kiểm tra này, trƣớc tiên tiến hành thiết lập một ma trận thể hiện khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý giữa các nhòm bò phân bố trên 28 xã nghiên cứu.
Trong đó một nửa ma trận thể hiện mối quan hệ về khoảng cách di truyền giữa các nhóm bò ở 28 xã, một nửa khác thể hiện mối quan hệ về khoảng cách địa lý giữa 28 xã. Khoảng cách địa lý giữa các xã đƣợc tính dựa trên vị trí địa lý đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định vị toàn cầu (GPS) của từng xã.
Sau đó sử dụng phép thử Mantel (Mantel test) của phần mềm Genetix để kiểm tra mối tƣơng quan này. Nếu kết quả phép kiểm tra có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 thì có nghĩa là có sự tƣơng quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý. Ngƣợc lai nếu p > 0,05 nghĩa là không có sự tƣơng quan giữa hai yếu tố này (Mantel, 1967) [86].
Xác định cấu trúc di truyền quần thể