Sau khi tiến hành giải và phân tích trình tự ADN vùng D-loop ty thể từ sản phẩm PCR của 26 mẫu bò ở Hà Giang chúng tôi thu đƣợc đoạn trình tự nucleotide có độ dài 530 bp trên độ dài 990 bp của sản phẩm PCR. Đoạn trình tự này có vị trí từ nucleotide 15813 đến 16343 của toàn bộ trình tự ADN ty thể đƣợc công bố bởi Anderson và cộng sự (1982) [15] với mã truy nhập trên ngân hàng gen Quốc tế là V00654.
So sánh trình tự vùng D-loop đồng thời của 67 mẫu bò bao gồm: bò ở Hà Giang (26 mẫu); Hàn Quốc (4 mẫu bò vàng); Nhật Bản (9 mẫu bò đen), Ấn Độ (6 mẫu gồm các giống Harianna, Sahiwal, Tharparkar); Châu Phi (8 mẫu gồm các giống: Butana, Fulani, Kenana và N’Dama); Châu Âu (12 mẫu gồm các giống: Aberdeen Angus, Charolais, Friesian, Here ford, Jersey và Simantal) và 2 mẫu đối chứng của bò có u Bos indicus và không có u Bos taurus, kết quả cho thấy xuất hiện 39 kiểu haplotype và có 50 điểm đa hình giữa các haplotype. Trong số 26 mẫu bò ở Hà Giang, chúng tôi đã xác định đƣợc 14 haplotype và giữa các haplotype này có 34 điểm đa hình (polymophic site). Các kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.9.
Qua hình 3.9 cho thấy trình tự ADN vùng D-loop ty thể ở quần thể bò ở Hà Giang đƣợc tách biệt thành hai nhóm (ký hiệu là H’mông 1 và H’mông 2): nhóm H’mông 1 gồm các mẫu có ký hiệu: VN1, VN14, VN8, VN11 VN17, VN14, VN22, VN23, V25, có trình tự của loài phụ Bos taurus (không có u) ; nhóm H’mông 2 gồm các mẫu: VN20, VN18, VN24, VN10, VN4, có trình tự của loài phụ Bos indicus
(bò có u). Trong số 26 mẫu bò H’mông đƣợc phân tích ngẫu nhiên, kết quả cho thấy có 14 mẫu thuộc loài phụ Bos indicus và 12 mẫu thuộc loài phụ Bos taurus với tỷ lệ tƣơng ứng là 54% và 46 % (Hình 3.10).
Hình 3.9: Sự đa dạng trình tự vùng D-loop ty thể của 67 mẫu bò phân tích. Ký hiệu của các mẫu đƣợc thể hiện ở cột thứ nhất: EU (Châu Âu); AF (Châu Phi); JP (Nhật Bản); KR (Hàn Quốc); VN (Viêt Nam); IN (Ấn Độ). V00654 và NC005971 tƣơng ứng là trình tự ADN ty thể chuẩn của mẫu bò Bos taurus và bò Bos indicus. Ký hiệu
3.1.2.8. Mối quan hệ di truyền của bò ở Hà Giang với mốt số quần thể bò khác
Khoảng cách di truyền giữa quần thể bò ở Hà Giang với một số quần thể bò khác đƣợc ƣớc lƣợng theo phƣơng pháp của Tamura-Nei (1993) [127] dựa trên sự sai khác trình tự ADN thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò nuôi và bò rừng Mỹ theo Tamura-Nei [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [1] Châu Âu 0,000 [2] Châu Phi 0,008 0,000 [3] Ấn Độ 0,060 0,061 0,000 [4] Nhật Bản 0,007 0,013 0,065 0,000 [5] Hàn Quốc 0,007 0,011 0,063 0,009 0,000 [6] H’mông 2 0,058 0,060 0,004 0,064 0,062 0,000 [7] H’mông 1 0,007 0,012 0,058 0,009 0,010 0,057 0,000 [8] Bò rừng Mỹ 0,135 0,133 0,140 0,139 0,139 0,137 0,133 0,000
Bảng 3.8 cho thấy khoảng cách di truyền giữa bò rừng Mỹ và các quần thể bò khác (Châu Âu, Châu Phi, Ấn Độ, Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản) đều lớn hơn 0,1. Trong khi đó, khoảng cách di truyền giữa bò Ấn Độ, H’mông 2 (thuộc loài phụ
Bos indicus) và các quần thể bò thuộc loài phụ Bos taurus của Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc, Châu Phi và H’mông 1 lớn hơn 0,05. Khoảng cách di truyền giữa quần thể bò Châu Âu, Châu Phi, Nhật Bản, Hàn Quốc và H’mông 1 dao động trong khoảng 0,007–0,012. Khoảng cách di truyền giữa nhóm bò H’Mông 2 và bò Bos indicus Ấn Độ là 0,004.
Ở cây phân loại di truyền (hình 3.10) cho thấy quần thể bò H’mông nhóm 1 và Châu Âu, Châu Phi, Hàn Quốc, Nhật Bản đều thuộc bò Bos taurus và có mối quan hệ gần nhau đồng thời chúng tách biệt so với bò Bos indicus Ấn Độ và bò rừng Mỹ.
Trong khi đó nhóm bò H’mông 2 có mối quan hệ di truyền rất gần với quần thể bò
Bos indicus Ấn Độ.
Mặc dù kết quả tính toán cho thấy mối quan hệ di truyền giữa nhóm bò Bos taurus ở Hà Giang (H’mông 1) và bò Bos tarus của Châu Âu, Hàn Quốc, Nhật Bản gần hơn (0,007 - 0,01) so với nhóm bò Châu Phi (0,012), tuy nhiên, sự khác nhau này là rất nhỏ. Do vậy ở cây phân loại (Hình 3.10) không cho thấy có sự tách biệt hẳn giữa các nhóm bò Châu Phi và H’mông 1, Châu Âu, Hàn Quốc, Nhật Bản. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng tƣơng tự với các kết quả nghiên cứu của tác giả Kim và cộng sự (2003) [63], khi nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số giống bò của Hàn Quốc cũng không cho thấy sự tách biệt giữa bò Hàn Quốc, Châu Âu và Châu Phi. Trong khi đó, Mannen và cộng sự (1998) khi nghiên cứu nguồn gốc của giống bò đen Nhật Bản (Bos taurus) dựa trên phân tích trình tự ADN ty thể đã cho thấy sự tách biệt giữa bò Châu Âu với bò Châu Phi. Đặc biệt, tác giả đã chỉ ra một số cá thể bò đen của Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần với bò Bos taurus của Châu Âu hơn là bò Bos taurus của Châu Phi. Nhƣ đã trình bày ở trên, một số giả thiết cho rằng các giống bò ngày nay có khả năng có nguồn gốc thuần hoá từ 3 khu vực khác nhau: Khu vực Tây Á là nơi thuần hoá bò Bos indicus bao gồm các giống bò có u Ấn Độ hiện nay, vùng Cận Đông là nơi thuần hoá bò Bos taurus (tổ tiên của các giống bò Bos taurus ở Châu Âu ngày này), ngoài ra, Châu Phi cũng có thể là nơi thuần hoá của bò Bos taurus khác (Bradley và cộng sự, 1996; Loftus và cộng sự, 1994; Troy và cộng sự, 2001).
Mặt khác, kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ bò thuộc loài phụ Bos indicus và
Bos taurus ở quần thể bò nuôi ở Hà Giang tƣơng ứng là 54% và 46 %, kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Phillips (1961) và Payne (1995). Các tác giả cho rằng các giống bò bản địa của Trung Quốc và Việt Nam có nguồn gốc từ sự lai tạp giữa bò có u (Bos indicus) và bò không có u (Bos taurus). Đồng thời kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Xin Cai và cộng sự (2006) khi nghiên cứu về phân loại tỷ lệ bò có nguồn gốc thuộc loài phụ Bos taurus
Trung Quốc. Trong đó kết quả chỉ ra, tỷ lệ bò không u (Bos taurus) chủ yếu tập trung ở phía Bắc với tỷ lệ 81,8-100% ở các giống và đƣợc cho là do du nhập từ Mông Cổ trong khoảng thời gian giữa 3766-3122 năm trƣớc Công Nguyên. Trong khi đó tỷ lệ bò có u (Bos indicus) chủ yếu tập trung ở phía Nam Trung Quốc với tỷ lệ 63,3-100% ở các giống.
Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã cung cấp bằng chứng ở mức độ phân tử về sự lai tạp giữa hai loài phụ Bos indicus và Bos taurus ở bò vàng Việt Nam nói chung và ở quần thể bò vàng ở Hà Giang nói riêng, phù hợp với các nhận định trƣớc đây về nguồn gốc của bò vàng Việt Nam từ bò Bos indius của Ấn Độ và bò Bos taurus từ Trung Quốc (Lê Viết Ly và cộng sự 1999). Tuy nhiên để làm sáng tỏ nguồn gốc của bò Vàng Việt Nam và bò nuôi ở Hà Giang cũng nhƣ những sự khác nhau trong các nghiên cứu của chúng tôi và của Mannen và cộng sự (1998) cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo trong đó cần tiến hành phân tích với số lƣợng mẫu nhiều hơn ở tất cả các nhóm bò vàng khác nhau hiện có ở Việt Nam. Hơn nữa, ngoài việc tiến hành phân tích trình tự ADN vùng D-loop cần tiến hành kết hợp phân tích tính đa hình hệ gen nhân bằng kỹ thuật microsatellite.
Hình 3.10: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền của 67 mẫu bò bao gồm: Việt Nam (VN), Hàn Quốc (KR), Nhật Bản (JP), Ấn Độ (IN), Châu Âu (EU), Châu
phi (AF), 5 mẫu bò rừng Châu Mỹ (Bison) và 2 mẫu bò có u và không có u đối chứng tƣơng ứng là V00654, NC00597. Giá trị hoành độ của cây thể hiện khoảng
cách di truyền JP U87635 JP U87633 KR AF409056 JP U87639 JP U87638 JP U87637 JP U87636 VN8 JP U87634 Bos taurusV00654 VN22 VN5 VN13 VN14 JP U87640 EU L27716 EU L27726 JP U87650 EU L27734 EU L27717 EU L27735 KR AF409055 EU L27718 EU L27719 EU L27727 EU L27712 EU L27725 KR AF409057 EU L27713 VN23 VN17 VN19 VN1 VN15 VN25 EU L27724 AF L27730 AF L27731 AF L27728 AF L27720 AF L27721 AF L27729 VN11 KR AF409054 AF L27714 AF L27715 VN4 VN20 VN24 IN L27723 VN18 IN L27722 IN L27732 IN L27736 IN L27737 IN L27733 Bos indicusNC005971 VN2 VN43 VN6 VN7 VN9 VN10 VN12 VN16 VN21 VN26 Bison U12946 Bison U51848 Bison U12936 Bison U12955 Bison U12959 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 Bò không u Bos taurus Bò có u Bos indicus Bò rừng Mỹ Bison bison
3.2. ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG HOANG DÃ DÃ
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN
Đối với các quần thể vật nuôi, công việc tách chiết ADN từ các mẫu mô, mẫu máu hiện nay đã trở nên hết sức đơn giản, tuy nhiên đối với các quần thể động vật hoang dã thì điều này lại rất khó khăn do không thể có đƣợc trực tiếp các mẫu mô và mẫu máu. Vì vậy công việc tách chiết ADN phải thực hiện trên các mẫu sinh học hiếm nguồn ADN nhƣ mẫu phân, lông.
Khác với kết quả tách chiết ADN từ các mẫu sinh học nhƣ: máu, mô, kết quả tách chiết ADN từ mẫu phân sẽ thu đƣợc ADN tạp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ: vi sinh vật, thực vật và của bản thân vật chủ, hơn nữa chúng thƣờng bị thoái hoá (đứt gãy). Do đó khi dùng các phƣơng pháp thông thƣờng hay đƣợc sử dụng nhƣ điện di trên gel agarose và máy đo quang phổ hấp thụ để kiểm tra sẽ không thể khẳng định đƣợc sự có mặt ADN của vật chủ cũng nhƣ định lƣợng đƣợc nồng độ và chất lƣợng trong các mẫu ADN thu đƣợc sau khi tách chiết.
Vì vậy, khi tiến hành nghiên cứu di truyền trên động vật hoang dã thì ngoài việc sử dụng một số chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền, một số chỉ thị cũng đồng thời đƣợc dùng để đánh giá mức độ thành công của việc tách chiết ADN từ các mẫu phân, lông... Một số chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng bằng kỹ thuật PCR nhƣ nhân bản vùng ADN D-loop của ty thể, các locút microsatellite và locút gen giới tính. Tỷ lệ thành công đƣợc đánh giá thông qua kết quả thành công của phản ứng nhân gen PCR.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi (primer) để nhân bản vùng D-loop ty thể và cặp mồi xác định giới tính của bò bằng kỹ thuật PCR. Nhƣ vậy, chỉ mẫu nào cho kết quả PCR dƣơng tính với hai cặp mồi này thì có nghĩa là trong mẫu ADN sau khi tách chiết có chứa ADN của bò và đƣợc cho là thành công trong việc tách chiết ADN của bò từ các mẫu phân (Hình 3.11 và 3.12).
Hình 3.11: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR vùng D-loop ở bò hoang dã
Các mẫu dƣơng tính (162, 164, 166, 167,169,170,171) có kết quả 1 băng 990 bp; neg: mẫu đối chứng âm tính không có ADN; M1kb: ADN thang chuẩn 1kb
Hình 3.12: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR với cặp mồi giới tính ở bò
hoang dã
Bò đực gồm 2 băng 178 và 145 bp ( 3, 6, 7), bò cái cho 1 băng 145 bp (2, 4, 5, 8) CT1: mẫu ADN tách chiết từ máu bò tót; neg: mẫu đối chứng âm tính không có
ADN; ULR: ADN thang chuẩn (ultra low range)
178 bp 145 bp 990 bp
Tổng hợp kết quả phân tích phản ứng PCR đối với cặp mồi D-loop và xác định giới tính từ 555 mẫu phân bò hoang dã ở Việt Nam và 4 mẫu phân ở các vƣờn thú trên thế giới, chúng tôi thu đƣợc 218 mẫu có kết quả PCR dƣơng tính, trong đó có 214 mẫu ở Việt Nam và 4 mẫu ở vƣờn thú Tây Ban Nha (Bảng 3.9). Các mẫu này đều có kết quả PCR dƣơng tính đối với cả hai cặp mồi xác định giới tính và cặp mồi D-loop và kích thƣớc của các băng sản phẩm PCR hoàn toàn giống với kích thƣớc sản phẩm PCR khi thực hiện trên mẫu ADN bò tót và bò rừng đƣợc tách từ mẫu mô và mẫu bò nuôi. Qua đó cho thấy, tỷ lệ thành công các mẫu sau khi tách chiết có chứa ADN của bò là xấp xỉ 40%.
Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân bò hoang dã
Địa điểm thu mẫu Loại mẫu Số mẫu thu thập
Số mẫu tách chiết ADN thành công Vƣờn quốc gia Cát Tiên-
Đồng Nai Phân 520 191
Khu bảo tồn thiên nhiên Ea
Sô-Đăk Lăk Phân 20 17
Vƣờn quốc gia Bù Gia
Mập-Bình Phƣớc Phân 8 4
Vƣờn Quốc Gia Yok Don-
Dăk Lăk Phân 4 1
Vƣờn quốc gia Phong Nha
Kẻ Bàng-Quảng Bình Phân 2 0
Thảo Cầm Viên thành phố
Hồ Chí Minh Phân 1 1
Vƣờn thú Madrid -Tây Ban
Nha Phân 4 4
Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới đều chỉ ra rằng tỷ lệ thành công khi tách chiết ADN từ các mẫu nhƣ lông, phân thu thập từ các quần thể hoang dã ở một số loài khác nhau là rất thấp (Taberlet và cộng sự, 1997; 1999; ) [124], [125]. Đặc biệt nếu sử dụng phƣơng pháp tách chiết ADN truyền thống trƣớc đây sử dụng phenol/chloroform sẽ không thu đƣợc kết quả. Chính vì vậy, một số phƣơng pháp
khác đã đƣợc phát triển để khắc phục hạn chế này. Phƣơng pháp chelex đƣợc sử dụng để tách chiết từ các mẫu lông, tóc (Singer-Sam và cộng sự, 1989; Walsh và cộng sự, 1991) [119], [136], phƣơng pháp silica đƣợc sử dụng để tách chiết từ các mẫu phân (Boom và cộng sự, 1990; Kohn và cộng sự ,1995) [24], [69] và phƣơng pháp sử dụng các bộ kít tách thƣơng mại (QIAamp, Qiagen) nhƣ chúng tôi đã sử dụng.
Theo Taberlet và cộng sự (1999) thì có sự khác nhau đáng kể về nồng độ và chất lƣợng ADN tách chiết đƣợc từ các mẫu lông, phân giữa các loài khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả thì khả năng tách chiết ADN ở phân chó sói tốt hơn là ở phân voi [124]. Theo kết quả nghiên cứu của Taberlet và cộng sự (1997) khi tiến hành nghiên cứu đặc điểm di truyền của quần thể gấu nâu Pyrenean từ các mẫu lông và phân cho thấy mặc dù tỷ lệ thành công tách chiết ADN đạt 50% nhƣng chỉ có 15% số mẫu tách từ lông và 20% tách từ phân có đủ nộng độ và chất lƣợng ADN cho các phân tích di truyền.
Nghiên cứu của Bellemain và cộng sự (2005) [21] trên quần thể gấu nâu ở Thụy Điển cho thấy, kết quả tách chiết ADN từ phân bằng bộ kít tách (QIAamp DNA stool Kit) đạt 70%-80 %. Tuy nhiên, số lƣợng mẫu có nồng độ và chất lƣợng đủ để tiến hành sử dụng phân tích di truyền ở một số chỉ thị phân tử thì tỷ lệ chỉ đạt 30%. Tƣơng tự ở một nghiên cứu khác của Bellemain và cộng sự (2007) [20] trên quần thể gấu nâu ở phía Bắc Pakistan khi tiến hành nhân PCR một số locút microsatellite trên 136 mẫu ADN sau khi tách chiết từ phân bằng bộ kít tách thì có 63 mẫu thành công, tỷ lệ đạt gần 46%.
Nghiên cứu trên quần thể rái cá ở phía nam nƣớc Pháp, Janssens và cộng sự (2006) [56] cho biết tỷ lệ thành công tách chiết ADN trên phân bằng bộ kít QIAamp DNA stool Kit đạt khoảng 73%. Theo Wehausen và cộng sự (2004) [139], do quá trình phân huỷ của môi trƣờng nên việc tách chiết ADN từ các mẫu thu thập bằng phƣơng pháp không gây hại cho sinh vật (phân, lông...) là rất khó khăn, thƣờng thu đƣợc nồng độ ADN rất thấp và bị đứt gãy.
Nhƣ vậy có thể thấy mức độ thành công khi tách chiết ADN từ các mẫu phân và lông là rất thấp và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ: đối tƣợng nghiên cứu, phƣơng pháp sử dụng tách chiết khác nhau, điều kiện bảo quản mẫu và các kỹ năng thao tác thí nghiệm.
3.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố bảo quản mẫu đến kết quả tách chiết ADN
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm tách chiết ADN từ các mẫu phân của bò tót thu tại công viên Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh trong các điều kiện thời gian bảo quản mẫu khác nhau ở cả hai loại dung dịch bảo quan mẫu là cồn và RNAlater. Các kết quả đều cho thấy, đối với các mẫu có thời gian bảo quản càng ngắn (tính từ lúc thu mẫu đến khi tiến hành tách chiết ADN) thì tỷ lệ thành công của