Nhƣ đã nêu, các mẫu phân đƣợc chúng tôi thu thập đều không rõ nguồn gốc về loài và giới tính vì vậy trong nghiên cứu này lần đầu tiên chúng tôi sử dụng phƣơng
pháp sinh học phân tử để xác định loài. Trƣớc tiên, để khẳng định trình tự ADN của locút gen cyt b và D-loop đƣợc lựa chọn có đảm bảo sự sai khác để phân biệt giữa các loài bò hoang dã và bò nuôi hay không, chúng tôi đã tiến hành nhân PCR sau đó giải và phân tích trình tự ADN của các locút gen này trên các mẫu bò nuôi, bò tót và bò rừng đã biết chính xác về loài (nuôi tại vƣờn thú Thành Phố Hồ Chí Minh và Paris-Cộng hoà Pháp). Sau khi tiến hành nhân PCR, kết quả đoạn gen cyt b có kích thƣớc 274 bp và vùng D-loop có kích thƣớc 990 bp. Sau khi giải trình tự và làm sạch chúng tôi thu đƣợc trình tự chính xác của vùng D-loop có kích thƣớc là 810 bp (xem phụ lục 1).
Các trình tự này sau đó đƣợc so sánh với nhau và với một số trình tự có sẵn khác trên ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). Tuy nhiên, trên ngân hàng gen chúng tôi chỉ tìm thấy trình tự ADN gen cyt b của bò nuôi, bò tót và bò rừng còn trình tự vùng D-loop của bò tót và bò rừng thì chỉ có một vài trình tự rất ngắn. Điều đó có thể thấy có rất ít các nghiên cứu về trình tự vùng D-loop của bò tót và bò rừng đƣợc thực hiện. Kết quả so sánh sự sai khác ở locút gen cyt b và vùng D-loop giữa bò nuôi và bò hoang dã đƣợc trình bày ở hình 3.14 và 3.15.
Hình 3.14 và 3.15 cho thấy sự sai khác trình tự ADN ở locút gen cyt b và vùng D-loop giữa loài bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus) và 2 loài bò tót và bò rừng hoang dã (Bos gaurus, Bos javanicus) là rất lớn. Thậm chí ngay cả giữa 2 loài phụ bò nuôi là Bos indicus và Bos taurus cũng có rất nhiều điểm sai khác. Đồng thời khi xây dựng cây phân loại di truyền (phylogenetic tree) dựa trên sự sai khác của các trình tự này cũng cho thấy chúng đƣợc phân thành các nhánh khác nhau (kết quả sẽ đƣợc trình bày chi tiết ở phần sau). Do vậy, hai locút gen cyt b và D-loop là những chỉ thỉ thị phân tử có thể dùng để phân biệt giữa các loài bò hoang dã và bò nuôi từ các mẫu sinh học không biết rõ nguồn gốc về loài. Tuy nhiên, do độ dài và mức độ đa hình của vùng D-loop cao hơn rất nhiều so với locút gen cyt b vì vậy để tiện lợi cho việc đồng thời xác định loài và phân tích đa dạng di truyền chúng tôi chỉ tập trung phân tích trình tự vùng D-loop.
Hình 3.14: So sánh trình tự ADN đoạn gen Cytochrome b giữa bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus), bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus) hoang dã. Ký hiệu: AY676873, AF419237, DQ319905, AY689188 là mã truy cập trên
Hình 3.15: So sánh trình tự ADN vùng D-loop giữa bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus), bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus) hoang dã
Tiến hành giải và phân tích trình tự ADN sản phẩm PCR vùng D-loop của toàn bộ 214 mẫu có kết quả PCR dƣơng tính từ các mẫu phân và da đầu chƣa xác định đƣợc loài ở các vƣờn quốc gia và khu bảo tồn của Việt Nam, kết quả chúng tôi đã xác định đƣợc 195 mẫu thuộc loài bò tót và 19 mẫu thuộc loài bò rừng. Trong số đó, toàn bộ số mẫu ở vƣờn quốc gia Cát Tiên thuộc loài bò tót (191 mẫu), khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô có 3 mẫu thuộc loài bò tót và 14 mẫu thuộc loài bò rừng, vƣờn quốc gia Bù Gia Mập có 1 mẫu bò tót và 3 mẫu bò rừng, vƣờn quốc gia Yok Đôn có 1 mẫu bò rừng và khu bảo tồn Krông Trai có 1 mẫu bò rừng (xem phụ lục 2).
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với sự phân bố các loài bò tót và bò rừng ở Việt Nam hiện nay đƣợc xác định qua các nghiên cứu điều tra khảo sát cũng nhƣ các thông tin từ các vụ săn bắn trái phép trƣớc đây (Nguyễn Mạnh Hà, 2008). Hiện tại quần thể bò tót và bò rừng ở Việt Nam bị phân tán thành các đàn nhỏ lẻ phân bố ở các vƣờn Quốc gia và các khu bảo tồn. Trong đó vƣờn Quốc gia Cát Tiên là nơi còn tồn tại một quần thể bò tót lớn nhất của Việt Nam. Theo các kết quả nghiên cứu điều tra của Hayes (2004); Ling (2000) [52], [76] đều không thấy có dấu vết của loài bò rừng (Bos javanicus) ở vƣờn Quốc gia Cát Tiên.