Đối với các quần thể vật nuôi, công việc tách chiết ADN từ các mẫu mô, mẫu máu hiện nay đã trở nên hết sức đơn giản, tuy nhiên đối với các quần thể động vật hoang dã thì điều này lại rất khó khăn do không thể có đƣợc trực tiếp các mẫu mô và mẫu máu. Vì vậy công việc tách chiết ADN phải thực hiện trên các mẫu sinh học hiếm nguồn ADN nhƣ mẫu phân, lông.
Khác với kết quả tách chiết ADN từ các mẫu sinh học nhƣ: máu, mô, kết quả tách chiết ADN từ mẫu phân sẽ thu đƣợc ADN tạp từ rất nhiều nguồn khác nhau nhƣ: vi sinh vật, thực vật và của bản thân vật chủ, hơn nữa chúng thƣờng bị thoái hoá (đứt gãy). Do đó khi dùng các phƣơng pháp thông thƣờng hay đƣợc sử dụng nhƣ điện di trên gel agarose và máy đo quang phổ hấp thụ để kiểm tra sẽ không thể khẳng định đƣợc sự có mặt ADN của vật chủ cũng nhƣ định lƣợng đƣợc nồng độ và chất lƣợng trong các mẫu ADN thu đƣợc sau khi tách chiết.
Vì vậy, khi tiến hành nghiên cứu di truyền trên động vật hoang dã thì ngoài việc sử dụng một số chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền, một số chỉ thị cũng đồng thời đƣợc dùng để đánh giá mức độ thành công của việc tách chiết ADN từ các mẫu phân, lông... Một số chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng bằng kỹ thuật PCR nhƣ nhân bản vùng ADN D-loop của ty thể, các locút microsatellite và locút gen giới tính. Tỷ lệ thành công đƣợc đánh giá thông qua kết quả thành công của phản ứng nhân gen PCR.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi (primer) để nhân bản vùng D-loop ty thể và cặp mồi xác định giới tính của bò bằng kỹ thuật PCR. Nhƣ vậy, chỉ mẫu nào cho kết quả PCR dƣơng tính với hai cặp mồi này thì có nghĩa là trong mẫu ADN sau khi tách chiết có chứa ADN của bò và đƣợc cho là thành công trong việc tách chiết ADN của bò từ các mẫu phân (Hình 3.11 và 3.12).
Hình 3.11: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR vùng D-loop ở bò hoang dã
Các mẫu dƣơng tính (162, 164, 166, 167,169,170,171) có kết quả 1 băng 990 bp; neg: mẫu đối chứng âm tính không có ADN; M1kb: ADN thang chuẩn 1kb
Hình 3.12: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR với cặp mồi giới tính ở bò
hoang dã
Bò đực gồm 2 băng 178 và 145 bp ( 3, 6, 7), bò cái cho 1 băng 145 bp (2, 4, 5, 8) CT1: mẫu ADN tách chiết từ máu bò tót; neg: mẫu đối chứng âm tính không có
ADN; ULR: ADN thang chuẩn (ultra low range)
178 bp 145 bp 990 bp
Tổng hợp kết quả phân tích phản ứng PCR đối với cặp mồi D-loop và xác định giới tính từ 555 mẫu phân bò hoang dã ở Việt Nam và 4 mẫu phân ở các vƣờn thú trên thế giới, chúng tôi thu đƣợc 218 mẫu có kết quả PCR dƣơng tính, trong đó có 214 mẫu ở Việt Nam và 4 mẫu ở vƣờn thú Tây Ban Nha (Bảng 3.9). Các mẫu này đều có kết quả PCR dƣơng tính đối với cả hai cặp mồi xác định giới tính và cặp mồi D-loop và kích thƣớc của các băng sản phẩm PCR hoàn toàn giống với kích thƣớc sản phẩm PCR khi thực hiện trên mẫu ADN bò tót và bò rừng đƣợc tách từ mẫu mô và mẫu bò nuôi. Qua đó cho thấy, tỷ lệ thành công các mẫu sau khi tách chiết có chứa ADN của bò là xấp xỉ 40%.
Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân bò hoang dã
Địa điểm thu mẫu Loại mẫu Số mẫu thu thập
Số mẫu tách chiết ADN thành công Vƣờn quốc gia Cát Tiên-
Đồng Nai Phân 520 191
Khu bảo tồn thiên nhiên Ea
Sô-Đăk Lăk Phân 20 17
Vƣờn quốc gia Bù Gia
Mập-Bình Phƣớc Phân 8 4
Vƣờn Quốc Gia Yok Don-
Dăk Lăk Phân 4 1
Vƣờn quốc gia Phong Nha
Kẻ Bàng-Quảng Bình Phân 2 0
Thảo Cầm Viên thành phố
Hồ Chí Minh Phân 1 1
Vƣờn thú Madrid -Tây Ban
Nha Phân 4 4
Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới đều chỉ ra rằng tỷ lệ thành công khi tách chiết ADN từ các mẫu nhƣ lông, phân thu thập từ các quần thể hoang dã ở một số loài khác nhau là rất thấp (Taberlet và cộng sự, 1997; 1999; ) [124], [125]. Đặc biệt nếu sử dụng phƣơng pháp tách chiết ADN truyền thống trƣớc đây sử dụng phenol/chloroform sẽ không thu đƣợc kết quả. Chính vì vậy, một số phƣơng pháp
khác đã đƣợc phát triển để khắc phục hạn chế này. Phƣơng pháp chelex đƣợc sử dụng để tách chiết từ các mẫu lông, tóc (Singer-Sam và cộng sự, 1989; Walsh và cộng sự, 1991) [119], [136], phƣơng pháp silica đƣợc sử dụng để tách chiết từ các mẫu phân (Boom và cộng sự, 1990; Kohn và cộng sự ,1995) [24], [69] và phƣơng pháp sử dụng các bộ kít tách thƣơng mại (QIAamp, Qiagen) nhƣ chúng tôi đã sử dụng.
Theo Taberlet và cộng sự (1999) thì có sự khác nhau đáng kể về nồng độ và chất lƣợng ADN tách chiết đƣợc từ các mẫu lông, phân giữa các loài khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả thì khả năng tách chiết ADN ở phân chó sói tốt hơn là ở phân voi [124]. Theo kết quả nghiên cứu của Taberlet và cộng sự (1997) khi tiến hành nghiên cứu đặc điểm di truyền của quần thể gấu nâu Pyrenean từ các mẫu lông và phân cho thấy mặc dù tỷ lệ thành công tách chiết ADN đạt 50% nhƣng chỉ có 15% số mẫu tách từ lông và 20% tách từ phân có đủ nộng độ và chất lƣợng ADN cho các phân tích di truyền.
Nghiên cứu của Bellemain và cộng sự (2005) [21] trên quần thể gấu nâu ở Thụy Điển cho thấy, kết quả tách chiết ADN từ phân bằng bộ kít tách (QIAamp DNA stool Kit) đạt 70%-80 %. Tuy nhiên, số lƣợng mẫu có nồng độ và chất lƣợng đủ để tiến hành sử dụng phân tích di truyền ở một số chỉ thị phân tử thì tỷ lệ chỉ đạt 30%. Tƣơng tự ở một nghiên cứu khác của Bellemain và cộng sự (2007) [20] trên quần thể gấu nâu ở phía Bắc Pakistan khi tiến hành nhân PCR một số locút microsatellite trên 136 mẫu ADN sau khi tách chiết từ phân bằng bộ kít tách thì có 63 mẫu thành công, tỷ lệ đạt gần 46%.
Nghiên cứu trên quần thể rái cá ở phía nam nƣớc Pháp, Janssens và cộng sự (2006) [56] cho biết tỷ lệ thành công tách chiết ADN trên phân bằng bộ kít QIAamp DNA stool Kit đạt khoảng 73%. Theo Wehausen và cộng sự (2004) [139], do quá trình phân huỷ của môi trƣờng nên việc tách chiết ADN từ các mẫu thu thập bằng phƣơng pháp không gây hại cho sinh vật (phân, lông...) là rất khó khăn, thƣờng thu đƣợc nồng độ ADN rất thấp và bị đứt gãy.
Nhƣ vậy có thể thấy mức độ thành công khi tách chiết ADN từ các mẫu phân và lông là rất thấp và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau nhƣ: đối tƣợng nghiên cứu, phƣơng pháp sử dụng tách chiết khác nhau, điều kiện bảo quản mẫu và các kỹ năng thao tác thí nghiệm.
3.2.2. Ảnh hƣởng của một số yếu tố bảo quản mẫu đến kết quả tách chiết ADN
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm tách chiết ADN từ các mẫu phân của bò tót thu tại công viên Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh trong các điều kiện thời gian bảo quản mẫu khác nhau ở cả hai loại dung dịch bảo quan mẫu là cồn và RNAlater. Các kết quả đều cho thấy, đối với các mẫu có thời gian bảo quản càng ngắn (tính từ lúc thu mẫu đến khi tiến hành tách chiết ADN) thì tỷ lệ thành công của phản ứng PCR càng cao. Đặc biệt đối với các mẫu không đƣợc bảo quản trong cả hai dung dịch nói trên phản ảnh kết quả này một cách rõ nét nhất.
Bên cạnh đó, chúng tôi đồng thời tiến hành phân tích trên các mẫu phân đƣợc thu thập từ thực địa (tại các vƣờn quốc gia và khu bảo tồn). Các mẫu này có thời gian đƣợc bảo quản khác nhau tính từ khi đƣợc thu thập ngoài thực địa đến khi đƣợc thực hiện tách chiết ADN trong phòng thí nghiệm. Phân tích này đƣợc thực hiện chung trên cả hai loại dung dịch bảo quản mẫu phân là cồn và RNAlater. Kết quả đƣợc đánh giá căn cứ trên sự thành công của phản ứng nhân gen PCR với cặp mồi xác định giới tính (Hình 3.13).
Kết quả ở hình 3.13 cho thấy đối với các mẫu có thời gian bảo quản dƣới 10 ngày cho tỷ lệ kết quả PCR dƣơng tính với cặp mồi giới tính là cao nhất (83%) và ở các mẫu có thời gian bảo quản 5-6 tháng thì tỷ lệ kết quả PCR dƣơng tính là thấp nhất (0,3%). Đây chính là lý do tại sao chúng tôi đã không thu đƣợc kết quả đối với các mẫu phân ở Vƣờn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng-Quảng Bình do thời gian bảo quản quá lâu (hơn 6 tháng).
Xác định giới tính và thời gian bảo quản phân 0 20 40 60 80 100 120 < 10 ngày 10-15 ngày 16-20 ngày 21-25 ngày 26-30 ngày 31-35 ngày 36-75 ngày 3-3.5 tháng 4-4.5 tháng 5-6 tháng
Thời gian bảo quản
Tỷ l ệ % Sex (-) (%) Sex (+) (%)
Hình 3.13: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ kết quả phản ứng PCR xác định giới tính đối với thời gian bảo quản mẫu khác nhau
Theo kết quả nghiên cứu của Bellemain và cộng sự (2007) [20] thì tỷ lệ tách chiết thành công ADN từ phân gấu đối với các mẫu có thời gian bảo quản từ 0-3 ngày là 60%, trong khi đó các mẫu có thời gian bảo quản trên 1 tháng thì tỷ lệ tách chiết thành công ADN giảm xuống còn khoảng 15%. Nhƣ vậy, có thể thấy thời gian bảo quản mẫu đã ảnh hƣởng đến kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân. Các mẫu càng bảo quản lâu thì tỷ lệ thành công tách chiết ADN càng thấp.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của dung dịch bảo quản đến kết quả tách chiết ADN
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của dung dịch bảo quản đến kết quả tách chiết ADN trên mẫu phân bò tót ở Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh cho thấy có sự khác nhau rõ rệt giữa các mẫu đƣợc bảo quản và không đƣợc bảo quản bằng các dung dịch cồn và RNAlater. Trong khi đó, chúng tôi không nhận thấy có sự sai khác giữa phƣơng pháp bảo quản bằng dung dịch cồn (100%) và RNAlater Kết quả này cũng hoàn toàn giống với kết quả khi chúng tôi tiến hành phân tích trên 540 mẫu phân đƣợc thu thập ngoài thực địa, các mẫu đƣợc bảo quản trong dung dịch cồn cho tỷ lệ kết quả PCR dƣơng tính là 38,77% và trong dung dịch RNAlater là 38,37%. Qua phép phân tích thống kê cũng cho thấy không có sự khác nhau giữa 2 phƣơng
pháp bảo quản này (p>0,05). Đây là một kết quả rất có ý nghĩa bởi giá thành của dung dịch bảo quản mẫu RNAlater cao hơn rất nhiều so với dụng dịch cồn vì vậy để tiết kiệm kinh phí chúng tôi khuyến cáo nên sử dụng cồn (100%) để bảo quản các mẫu phân khi thực hiện nghiên cứu ở các quần thể động vật hoang dã.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN
Kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản đến kết quả tách chiết ADN trên mẫu phân bò tót thu tại công viên Thảo Cầm Viên thành phố Hồ Chí Minh cho thấy nhiệt độ bảo quản có ảnh hƣởng rõ rệt đến kết quả tách chiết ADN. Các mẫu đƣợc bảo quản ở 40C cho tỷ lệ thành công nhân PCR cao hơn rõ rệt so với các mẫu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ ngoài trời (khoảng 350C). Đặc biệt với các mẫu phân không đƣợc bảo quản bằng các dung dịch cồn hoặc RNAlater nhƣng đƣợc bảo ở các nhiệt độ khác nhau tại 40
C và khoảng 350C cho thấy kết quả tách chiết ADN bị giảm đi rõ rệt sau 2 ngày bảo quản ở khoảng 350C, trong khi đó mẫu đƣợc bảo quản ở 40C vẫn cho kết quả tốt sau 2 ngày bảo quản. Theo kết quả nghiên cứu của Maudet và cộng sự (2004) [89] thì tỷ lệ thành công của phản ứng PCR đạt 95% đối với các mẫu phân của loài dê núi hoang dã (Capra ibex) đƣợc thu thập vào mùa đông trong khi đó các mẫu phân đƣợc thu thập vào mùa xuân thì tỷ lệ thành công của phản ứng PCR chỉ đạt 59%. Tƣơng tự, Goossens và cộng sự (2000); Huber và cộng sự (2003) [46], [53] cũng chỉ ra rằng nhiệt độ bảo quản và các phƣơng pháp bảo quản mẫu có ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả tách chiết ADN.
Dƣới điều kiện khí hậu nhiệt đới nhƣ ở Việt Nam thì các yếu tố nhƣ nhiệt độ, độ ẩm và cƣờng độ mạnh của các tia UV là những tác nhân ảnh hƣởng lớn đến sự phân huỷ của tế bào và phân tử ADN. Vì vậy, theo chúng tôi để tăng hiệu suất của kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân nên bảo quản mẫu trong cồn và ở 40C ngay sau khi đƣợc thu thập.
3.2.3. Kết quả xác định loài
Nhƣ đã nêu, các mẫu phân đƣợc chúng tôi thu thập đều không rõ nguồn gốc về loài và giới tính vì vậy trong nghiên cứu này lần đầu tiên chúng tôi sử dụng phƣơng
pháp sinh học phân tử để xác định loài. Trƣớc tiên, để khẳng định trình tự ADN của locút gen cyt b và D-loop đƣợc lựa chọn có đảm bảo sự sai khác để phân biệt giữa các loài bò hoang dã và bò nuôi hay không, chúng tôi đã tiến hành nhân PCR sau đó giải và phân tích trình tự ADN của các locút gen này trên các mẫu bò nuôi, bò tót và bò rừng đã biết chính xác về loài (nuôi tại vƣờn thú Thành Phố Hồ Chí Minh và Paris-Cộng hoà Pháp). Sau khi tiến hành nhân PCR, kết quả đoạn gen cyt b có kích thƣớc 274 bp và vùng D-loop có kích thƣớc 990 bp. Sau khi giải trình tự và làm sạch chúng tôi thu đƣợc trình tự chính xác của vùng D-loop có kích thƣớc là 810 bp (xem phụ lục 1).
Các trình tự này sau đó đƣợc so sánh với nhau và với một số trình tự có sẵn khác trên ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank). Tuy nhiên, trên ngân hàng gen chúng tôi chỉ tìm thấy trình tự ADN gen cyt b của bò nuôi, bò tót và bò rừng còn trình tự vùng D-loop của bò tót và bò rừng thì chỉ có một vài trình tự rất ngắn. Điều đó có thể thấy có rất ít các nghiên cứu về trình tự vùng D-loop của bò tót và bò rừng đƣợc thực hiện. Kết quả so sánh sự sai khác ở locút gen cyt b và vùng D-loop giữa bò nuôi và bò hoang dã đƣợc trình bày ở hình 3.14 và 3.15.
Hình 3.14 và 3.15 cho thấy sự sai khác trình tự ADN ở locút gen cyt b và vùng D-loop giữa loài bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus) và 2 loài bò tót và bò rừng hoang dã (Bos gaurus, Bos javanicus) là rất lớn. Thậm chí ngay cả giữa 2 loài phụ bò nuôi là Bos indicus và Bos taurus cũng có rất nhiều điểm sai khác. Đồng thời khi xây dựng cây phân loại di truyền (phylogenetic tree) dựa trên sự sai khác của các trình tự này cũng cho thấy chúng đƣợc phân thành các nhánh khác nhau (kết quả sẽ đƣợc trình bày chi tiết ở phần sau). Do vậy, hai locút gen cyt b và D-loop là những chỉ thỉ thị phân tử có thể dùng để phân biệt giữa các loài bò hoang dã và bò nuôi từ các mẫu sinh học không biết rõ nguồn gốc về loài. Tuy nhiên, do độ dài và mức độ đa hình của vùng D-loop cao hơn rất nhiều so với locút gen cyt b vì vậy để tiện lợi cho việc đồng thời xác định loài và phân tích đa dạng di truyền chúng tôi chỉ tập trung phân tích trình tự vùng D-loop.
Hình 3.14: So sánh trình tự ADN đoạn gen Cytochrome b giữa bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus), bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus) hoang dã. Ký hiệu: AY676873, AF419237, DQ319905, AY689188 là mã truy cập trên
Hình 3.15: So sánh trình tự ADN vùng D-loop giữa bò nuôi (Bos indicus, Bos taurus), bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos javanicus) hoang dã
Tiến hành giải và phân tích trình tự ADN sản phẩm PCR vùng D-loop của toàn bộ 214 mẫu có kết quả PCR dƣơng tính từ các mẫu phân và da đầu chƣa xác định đƣợc loài ở các vƣờn quốc gia và khu bảo tồn của Việt Nam, kết quả chúng tôi