V- XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM,KHÁNG KHUẨN:
V.1: Các phương pháp định tính phát hiện tính kháng khuẩn: [10] Phương pháp này cho ta thấy rõ phạm vi tác dụng và cũng cho ta hiểu biết
Phương pháp này cho ta thấy rõ phạm vi tác dụng và cũng cho ta hiểu biết sơ bộ về khả năng của loại kháng khuẩn tố đang cịn ở giai đoạn thơ.
V.1.1: Phương pháp trộn thuốc vào mơi trường thạch:
Chất chiết rút được pha lỗng với dung dịch đệm cĩ nồng độ xác định. Dung dịch này trộn đều với mơi trường nuơi cấy và để ở nhiệt độ 480C – 500C, đổ ra từng hộp lồng với một lượng nhất định. Sau khi cho thạch đơng lại và cấy các chủng vi sinh vật đã được chuẩn bị từ trước, dùng que cấy vơ trùng lấy các chủng vi sinh vật gốc cấy lên trên mặt mơi trường thành từng vạch thẳng, sau đĩ để hộp lồng trong điều kiện thích hợp, từ 18 đến 20 giờ cho vi khuẩn mọc lên; chúng ta nhận định kết quả bằng sự quan sát vi khuẩn mọc thành từng khuẩn lạc, hay khơng mọc được so với mẫu đối chứng làm trong cùng một điều kiện, nhưng khơng trộn lẫn thuốc vào mơi trường nuơi cấy.
V.1.2: Phương pháp đụïc lỗ trong mơi trường thạch:
Trong hộp lồng, đổ mơi trường thạch nĩng chảy, để đơng lại, sau đĩ cấy vi khuẩn đều khắp trên mặt. Dùng ống khoan lỗ cĩ kích thước quy định khoan vào thạch để tạo ra một lỗ trịn. Đổ mẫu thuốc cần nghiên cứu vào lỗ trịn đĩ rồi để vào tủ ấm 370C sau 18 giờ. Phương pháp này cho kết quả rõ ràng, do chất kháng khuẩn ngấm trực tiếp vào mơi trường.
V.1.3: Phương pháp thấm giấy:
Giấy thấm cắt thành hình trịn cĩ đường kính khoảng 33.5 – 34.0 mg, sấy vơ trùng. Cho những giấy này thấm vào dung dịch cĩ chứa chất kháng khuẩn, rồi hong khơ. Đặt các giấy này lên mặt mơi trường thạch đã gieo cấy vi khuẩn, để tất cả vào tủ ấm 370C sau 18 – 20 giờ, đem ra đọc kết quả. Chỗ thạch cĩ chất kháng khuẩn ngấm ra, vi khuẩn khơng phát triển được. Phương pháp này chỉ thích hợp khi phát hiện loại kháng khuẩn cĩ hoạt tính mạnh. Ngồi ra cịn ảnh
hưởng khá nhiều nếu lượng vi khuẩn cho vào mơi trường mỗi thí nghiệm khơng hằng định.
V.1.4: Phương pháp ống trụ của “Heatley”:
Dùng hộp lồng cĩ đường kính 10cm, đáy bằng phẳng, đổ vào khoảng 10ml mơi trường thạch đã đun chảy, để cho đặc lại. Đun chảy một bình mơi trường thạch khác cĩ chứa 20ml, chờ khi nhiệt độ của mơi trường trở về 420C – 440C, cho vào 0.2ml vi khuẩn đã cấy vào canh thang mọc tốt, trước đĩ 12 giờ, lắc đều mơi trường và vi khuẩn rồi đổ ra hộp thạch nĩi ở trên một lớp mỏng khoảng 4ml; lớp này sẽ đơng lại sau 10 – 15 phút. Đặt lên mặt lớp thạch những vịng kim loại khơng gỉ, vịng này cao 9.6mm, đường kính ngồi 7.2mm, đường kính trong 5 mm, mỗi vịng kim loại cĩ khối lượng khơng nhẹ quá 1.7g để đảm bảo độ lún vào thạch. Đổ dung dịch cần nghiên cứu vào các vịng nĩi trên với nồng độ và khối lượng nhất định, rồi nhẹ nhàng để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ. Sau thời gian này, ta sẽ thấy vi khuẩn phát triển thành một màu trắng đục, đều khắp mặt mơi trường, cịn quanh vịng kim loại cĩ thể cĩ một vùng trong, vùng trong chứng tỏ vi khuẩn khơng mọc được. Phương pháp này rất thường dùng cho việc phát hiện tính kháng khuẩn, cĩ ưu điểm đảm bảo an tồn cho người thực hành kỹ thuật, ít bị nhiễm trùng, kết quả rõ ràng.
V.1.5: Phương pháp đào rãnh của Fleming (1932):
Phương pháp này dùng để kiểm nghiệm tính kháng khuẩn của các giống điều chế ra Penixilin. Mơi trường thạch nấu chảy đổ vào hộp lồng, chờ cho đơng lại, dùng dao nhỏ vơ trùng cắt hai đường song song gần giữa hộp ( hai đường này cách nhau 0.3cm ), bỏ thỏi thạch ở giữa đi, đổ dung dịch thuốc định thử vào rãnh. Cấy vi khuẩn thành đường thẳng gĩc với rãnh. Để vào tủ ấm 370C trong 18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vơ khuẩn từ chân rãnh trở ra.
V.1.6: Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ ( 1956):
Các mẫu thuốc được nghiền nát, ép thành viên hình trụ, cao 0.8cm, đường kính 1 – 2cm. Đặt những viên đĩ lên một hộp mơi trường thạch, đặt hộp này vào tủ lạnh 40C trong 6 giờ, để hoạt chất kháng khuẩn từ dược liệu khuếch tán vào
dụng cụ đặc biệt phun lên trên mặt mơi trường một lớp vi khuẩn, đậy nắp lại, để vào tủ ấm 370C trong 12 – 18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vơ khuẩn quanh viên nén. Phương pháp này tránh được dùng nhiều vịng kim loại nhưng phải dùng những phương tiện cồng kềnh khác. Cũng cịn phải rất thận trọng để tránh lây lan khi phải dùng những loại vi khuẩn độc để thí nghiệm.
V.1.7: Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi:
Phương pháp này được Rundat đề xuất lần đầu tiên khi nghiên cứu chất kháng khuẩn bay hơi từ hạt đu đủ.
Nội dung của phương pháp là : Dùng hai nửa hộp lồng cĩ đường kính bằng nhau, đổ mơi trường thạch nĩng chảy vào nửa hộp lồng phía đáy, để cho mơi trường đơng lại, cấy vi khuẩn thành từng đường thẳng. Nửa hộp lồng kia để các chất tinh dầu hay những thực vật cĩ chất bay hơi giã dập. Gắn khe hở bằng băng dính hoặc paraphin, để tủ ấm 370C, sau 12 – 18 giờ đọc kết quả, so sánh với đối chứng. Chất bay hơi cĩ tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật đem thử. Phương pháp này cho phép phát hiện được những chất bay hơi mang tính kháng khuẩn mà các phương pháp kể trên khơng thể phát hiện được.
V.1.8: Phương pháp sắc ký kháng khuẩn:
Việc phân tích kháng khuẩn tố ở giai đoạn đầu trong quá trình nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký giấy được nhà bác học Ichida (80) áp dụng trước tiên, sau đĩ đã được nhiều người cải tiến thêm. Mặc dù cĩ rất nhiều tài liệu đề cập đến việc sử dụng phương pháp sắc ký trên giấy nhưng cho đến nay, vẫn chưa cĩ một quan điểm thống nhất về hệ thống hĩa các kháng khuẩn tố bằng phương pháp này.
Phương pháp tĩm tắt như sau : Chất đem thử được hịa tan trong dung mơi thích hợp, sau đĩ dùng loại dụng cụ đặc biệt để lấy chất thử, chấm nhiều lần vào một điểm trên giấy ( loại giấy riêng biệt để làm sắc ký ), đường kính của vết khơng quá 6 – 8mm. Cho chạy thăm dị với từng hệ dung mơi trong một bình thủy tinh kín, đã được bão hịa trước tướng khơng di động. Trong sắc ký ngược, tờ giấy được giữ ở phía trên bình và thả đầu kia ( đầu cĩ chấm chất thử ) xuống màng đựng tướng di động ngập tới 2 – 3cm, cách điểm chấm chất thử 3 – 4cm. Cĩ thể dùng phương pháp sắc ký xuơi hoặc phương pháp sắc ký vịng. Sau khi đã chạy xong phần sắc ký, giấy được đuổi hết dung mơi và hong khơ. Đặt các băng
giấy trên mơi trường thạch đã cấy vi khuẩn, để ở nhiệt độ 370C/12giờ cho vi khuẩn phát triển ta sẽ được vùng vơ khuẩn ở vết sắc ký mang hoạt tính kháng khuẩn.
Phương pháp này cĩ ưu điểm là tách biệt được chất kháng khuẩn ra khỏi nhiều chất khác. Xác định được chỉ số Rf của vết kháng khuẩn, cho phép ta đi sâu nghiên cứu thành phần và cấu trúc của chúng.