V.1: Các phương pháp định tính phát hiện tính kháng khuẩn: [10]
Phương phỏp này cho ta thấy rừ phạm vi tỏc dụng và cũng cho ta hiểu biết sơ bộ về khả năng của loại kháng khuẩn tố đang còn ở giai đoạn thô.
V.1.1: Phương pháp trộn thuốc vào môi trường thạch:
Chất chiết rút được pha loãng với dung dịch đệm có nồng độ xác định.
Dung dịch này trộn đều với môi trường nuôi cấy và để ở nhiệt độ 480C – 500C, đổ ra từng hộp lồng với một lượng nhất định. Sau khi cho thạch đông lại và cấy các chủng vi sinh vật đã được chuẩn bị từ trước, dùng que cấy vô trùng lấy các chủng vi sinh vật gốc cấy lên trên mặt môi trường thành từng vạch thẳng, sau đó để hộp lồng trong điều kiện thích hợp, từ 18 đến 20 giờ cho vi khuẩn mọc lên;
chúng ta nhận định kết quả bằng sự quan sát vi khuẩn mọc thành từng khuẩn lạc, hay không mọc được so với mẫu đối chứng làm trong cùng một điều kiện, nhưng không trộn lẫn thuốc vào môi trường nuôi cấy.
V.1.2: Phương phỏp đụùc lỗ trong mụi trường thạch:
Trong hộp lồng, đổ môi trường thạch nóng chảy, để đông lại, sau đó cấy vi khuẩn đều khắp trên mặt. Dùng ống khoan lỗ có kích thước quy định khoan vào thạch để tạo ra một lỗ tròn. Đổ mẫu thuốc cần nghiên cứu vào lỗ tròn đó rồi để vào tủ ấm 370C sau 18 giờ. Phương phỏp này cho kết quả rừ ràng, do chất khỏng khuẩn ngấm trực tiếp vào môi trường.
V.1.3: Phương pháp thấm giấy:
Giấy thấm cắt thành hình tròn có đường kính khoảng 33.5 – 34.0 mg, sấy vô trùng. Cho những giấy này thấm vào dung dịch có chứa chất kháng khuẩn, rồi hong khô. Đặt các giấy này lên mặt môi trường thạch đã gieo cấy vi khuẩn, để tất cả vào tủ ấm 370C sau 18 – 20 giờ, đem ra đọc kết quả. Chỗ thạch có chất kháng khuẩn ngấm ra, vi khuẩn không phát triển được. Phương pháp này chỉ thích hợp khi phát hiện loại kháng khuẩn có hoạt tính mạnh. Ngoài ra còn ảnh
hưởng khá nhiều nếu lượng vi khuẩn cho vào môi trường mỗi thí nghiệm không haống ủũnh.
V.1.4: Phương pháp ống trụ của “Heatley”:
Dùng hộp lồng có đường kính 10cm, đáy bằng phẳng, đổ vào khoảng 10ml môi trường thạch đã đun chảy, để cho đặc lại. Đun chảy một bình môi trường thạch khác có chứa 20ml, chờ khi nhiệt độ của môi trường trở về 420C – 440C, cho vào 0.2ml vi khuẩn đã cấy vào canh thang mọc tốt, trước đó 12 giờ, lắc đều môi trường và vi khuẩn rồi đổ ra hộp thạch nói ở trên một lớp mỏng khoảng 4ml;
lớp này sẽ đông lại sau 10 – 15 phút. Đặt lên mặt lớp thạch những vòng kim loại không gỉ, vòng này cao 9.6mm, đường kính ngoài 7.2mm, đường kính trong 5 mm, mỗi vòng kim loại có khối lượng không nhẹ quá 1.7g để đảm bảo độ lún vào thạch. Đổ dung dịch cần nghiên cứu vào các vòng nói trên với nồng độ và khối lượng nhất định, rồi nhẹ nhàng để vào tủ ấm 370C khoảng 18 giờ. Sau thời gian này, ta sẽ thấy vi khuẩn phát triển thành một màu trắng đục, đều khắp mặt môi trường, còn quanh vòng kim loại có thể có một vùng trong, vùng trong chứng tỏ vi khuẩn không mọc được. Phương pháp này rất thường dùng cho việc phát hiện tính kháng khuẩn, có ưu điểm đảm bảo an toàn cho người thực hành kỹ thuật, ớt bị nhiễm trựng, kết quả rừ ràng.
V.1.5: Phương pháp đào rãnh của Fleming (1932):
Phương pháp này dùng để kiểm nghiệm tính kháng khuẩn của các giống điều chế ra Penixilin. Môi trường thạch nấu chảy đổ vào hộp lồng, chờ cho đông lại, dùng dao nhỏ vô trùng cắt hai đường song song gần giữa hộp ( hai đường này cách nhau 0.3cm ), bỏ thỏi thạch ở giữa đi, đổ dung dịch thuốc định thử vào rãnh.
Cấy vi khuẩn thành đường thẳng góc với rãnh. Để vào tủ ấm 370C trong 18 giờ.
Đọc kết quả bằng cách đo vùng vô khuẩn từ chân rãnh trở ra.
V.1.6: Phương pháp viên nén Đặng Văn Ngữ ( 1956):
Các mẫu thuốc được nghiền nát, ép thành viên hình trụ, cao 0.8cm, đường kính 1 – 2cm. Đặt những viên đó lên một hộp môi trường thạch, đặt hộp này vào tủ lạnh 40C trong 6 giờ, để hoạt chất kháng khuẩn từ dược liệu khuếch tán vào
dụng cụ đặc biệt phun lên trên mặt môi trường một lớp vi khuẩn, đậy nắp lại, để vào tủ ấm 370C trong 12 – 18 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo vùng vô khuẩn quanh viên nén. Phương pháp này tránh được dùng nhiều vòng kim loại nhưng phải dùng những phương tiện cồng kềnh khác. Cũng còn phải rất thận trọng để tránh lây lan khi phải dùng những loại vi khuẩn độc để thí nghiệm.
V.1.7: Phương pháp thử những chất kháng khuẩn bay hơi:
Phương pháp này được Rundat đề xuất lần đầu tiên khi nghiên cứu chất kháng khuẩn bay hơi từ hạt đu đủ.
Nội dung của phương pháp là : Dùng hai nửa hộp lồng có đường kính bằng nhau, đổ môi trường thạch nóng chảy vào nửa hộp lồng phía đáy, để cho môi trường đông lại, cấy vi khuẩn thành từng đường thẳng. Nửa hộp lồng kia để các chất tinh dầu hay những thực vật có chất bay hơi giã dập. Gắn khe hở bằng băng dính hoặc paraphin, để tủ ấm 370C, sau 12 – 18 giờ đọc kết quả, so sánh với đối chứng. Chất bay hơi có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật đem thử.
Phương pháp này cho phép phát hiện được những chất bay hơi mang tính kháng khuẩn mà các phương pháp kể trên không thể phát hiện được.
V.1.8: Phương pháp sắc ký kháng khuẩn:
Việc phân tích kháng khuẩn tố ở giai đoạn đầu trong quá trình nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký giấy được nhà bác học Ichida (80) áp dụng trước tiên, sau đó đã được nhiều người cải tiến thêm. Mặc dù có rất nhiều tài liệu đề cập đến việc sử dụng phương pháp sắc ký trên giấy nhưng cho đến nay, vẫn chưa có một quan điểm thống nhất về hệ thống hóa các kháng khuẩn tố bằng phương pháp này.
Phương pháp tóm tắt như sau : Chất đem thử được hòa tan trong dung môi thích hợp, sau đó dùng loại dụng cụ đặc biệt để lấy chất thử, chấm nhiều lần vào một điểm trên giấy ( loại giấy riêng biệt để làm sắc ký ), đường kính của vết không quá 6 – 8mm. Cho chạy thăm dò với từng hệ dung môi trong một bình thủy tinh kín, đã được bão hòa trước tướng không di động. Trong sắc ký ngược, tờ giấy được giữ ở phía trên bình và thả đầu kia ( đầu có chấm chất thử ) xuống màng đựng tướng di động ngập tới 2 – 3cm, cách điểm chấm chất thử 3 – 4cm.
Có thể dùng phương pháp sắc ký xuôi hoặc phương pháp sắc ký vòng. Sau khi đã chạy xong phần sắc ký, giấy được đuổi hết dung môi và hong khô. Đặt các băng
giấy trên môi trường thạch đã cấy vi khuẩn, để ở nhiệt độ 370C/12giờ cho vi khuẩn phát triển ta sẽ được vùng vô khuẩn ở vết sắc ký mang hoạt tính kháng khuaồn.
Phương pháp này có ưu điểm là tách biệt được chất kháng khuẩn ra khỏi nhiều chất khác. Xác định được chỉ số Rf của vết kháng khuẩn, cho phép ta đi sâu nghiên cứu thành phần và cấu trúc của chúng.
V.2: Các loại vi khuẩn, vi nấm sử dụng để xác định hoạt tính: [11], [12]
V.2.1: Vi khuaồn:
• Staphylococcus aureus:
- Là vi khuẩn Gram (+), không giáp mô, không tạo bào tử.
- Sức đề kháng: nhạy cảm với penicillin, authromycin và ampicillin.
- Khả năng gây bệnh:
+ sưng mủ trên da, niêm mạc + gây ung nhọt, áp xe
+ viêm vú ở bò, cừu
+ gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa và viêm tủy xương.
• Bacillus subtilis:
- Là vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn.
- Là vi khuẩn có lợi, có mặt ở đường ruột.
• Pseudomonas aeruginosa:
- Là vi khuẩn Gram (-), có tiên mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh.
- Khả năng gây bệnh:
+ gây bệnh mủ xanh ở người và động vật + viêm bàng quan, viêm tai có mủ ở người
- Là vi khuẩn Gram (-), không bào tử,
- Sức đề kháng: nhạy cảm với Chloramphenicol, Streptomycine, Sulfamid, Trimethoprim.
-
- Khả năng gây bệnh: E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm thì E.coli mới gây bệnh.
+ gây tiêu chảy
+ bệnh phù thủng ở heo con + viêm ruột
• Enterococcus faecalis:
- Enterococcus là một phụ nhóm của Streptococcus, nhóm D. Là vi khuẩn Gram (+), dạng cầu, không bào tử.
- Khả năng gây bệnh: trên da, đường tiêu hóa, dạ dày, ruột và niệu, sinh dục.
V.2.2: Naám:
• Aspergillus:
- Là loại nấm mốc có khả năng sinh độc tố gây ung thư là Aflatoxin.
- Đặc điểm hình dạng: hình bông màu lục, cuống sinh bào tử.
+ Aspergillus flavus: thể bình, 1 hay 2 tầng trên cùng một bọng. Bông hình phóng xạ hay hình cột lỏng lẻo, cuống sinh bào tử dài không quá 1mm.
+ Aspergillus oryzae: cuống sinh bào tử dài 1-2 mm. Thể bình hai lớp, khi già màu hơi nâu.
- Khả năng gây bệnh của Aflatoxin:
+ Ở gia súc: . khi trúng độc cấp tính: chết đột ngột.
. mãn tính: con vật kém ăn, chậm lớn, sụt cân.
. khi nhiễm độc kéo dài: gây ung thư + Ở người: gây ung thư.
• Trichoderma sp.:
- Thuộc dạng vi nấm, sống trong môi trường đất.
- Hình dạng: có khuẩn ty không màu, cuống mang bào tử phân nhánh, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn đính các bào tử trần màu lục liên kết với nhau nhờ chất nhầy. Hình thức sinh sản bằng bào tử.
PHAÀN 2:
PHƯƠNG PHÁP