II. Giới thiệu về ngô chuyển gen
3.7.Phân tích xác nhận cây chuyển gen và đánh giá mức độ biểu hiện
3. Các bước tạo giống ngô chuyển gen trong phòng thí nghiệm
3.7.Phân tích xác nhận cây chuyển gen và đánh giá mức độ biểu hiện
Thực tế là một cây sau biến nạp sinh trưởng trên môi trường chọn lọc thì chưa đủ cơ sở để nói là một biến nạp thành công, vì có thể là tính kháng xuất hiện tự nhiên do một đột biến trong vật chất di truyền của thực vật. Hơn nữa tỷ lệ biến nạp thấp chỉ khoảng 10-8 đến 10-6. Vì vậy phải thực hiện các thí nghiệm bổ sung như Southern Blot hay PCR và các thí nghiệm khác để chứng minh sản phẩm của gen.
Phương pháp PCR rất nhạy và thích hợp khi có nhiều mẫu khác nhau và có một lượng rất ít DNA từ những thực phẩm biến đổi gen được phân lập. Phương pháp này đặc biệt phù hợp cho mục đích kiểm tra và xác nhận những thay đổi gen ở cây trồng và thực phẩm.
Để thực hiện phản ứng PCR xác định cây chuyển gen, ta lấy mẫu từ cây cần xác định. Sau đó tiến hành phá vỡ tế bào bằng cách nghiền mô tế bào trong hỗn hợp chất tẩy rửa SDS và proteinase K. Các bước tiếp theo tiến hành như tinh sạch
plasmid từ B. thuringiensis. Gen sau tinh sạch, được pha loãng với nước cất với Gen cryIA(b) được khuếch đại bằng cách sử dụng hai cặp mồi cryIA(b) – V3 và
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 69
Bảng 4.5. Trình tự của mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Primer Trình tự Mã số Vị trí cryIA(b) – V3 5'- CCTGACCAAGAGCACCAACCTGG- 3' I41419 1425- 1447 cryIA(b) – V4 5'- GCTCATGGTGGCGCTGAAGTTGC-3' I41419 1668- 1646
Hỗn hợp phản ứng chứa 1x AmpliTaq đệm, 25 mM MgCl2, 2.5 mM dATP, 2.5 mM dCTP, 2.5mM dGTP, 2.5 mM dTTP, 2.5 µM mỗi primer, 10 µl DNA mẫu và 2.5 U của AmpliTaq DNA polymerase.
Thông số khuếch đại gen cryIA(b): giai đoạn đầu biến tính: 12 phút ở 95ºC, thực hiện phản ứng PCR với 40 chu kỳ (1 phút ở 95ºC, 30 giây ở 58ºC, 30 giây tại 72ºC), giai đoạn cuối kết thúc phản ứng trong thời gian 10 phút ở 72ºC; Sau khi khuếch đại gen cryIA(b) ta cho chạy điện di trên gel agarose, nồng độ agarose sử dụng tùy vào kích thước của gen cần phân tách.
Ví dụ kết quả chạy điện di sau khi thực hiện phản ứng PCR ( Trần Thị Lệ, 2007) ( theo Zhu B, Ma BL, Blackshaw RE., 2010) [54].
Hình 4.4 : Xác nhận thay đổi gen ở ngô biến đổi gen.
Điện di trên gel agarose với các đoạn DNA đƣợc phân tách sau khi thực hiện phản ứng PCR. Năm cặp primer đƣợc sử dụng (AmpR: gen kháng
ampicillin, bar: kháng thuốc diệt cỏ, 35S bar: promoter kháng thuốc diệt cỏ, cryIA: gen tạo độc tố ở Bt.. ivrl: gen mã hóa invertase ở ngô), M: DNA từ ngô bình thƣờng, T: DNA từ ngô biến đổi gen. Bên phải là marker chuẩn (SM) để xác định kích thƣớc của các đoạn PCR
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 70
Từ thí nghiệm trên có thể rút ra những kết luận sau:
+ Đối chứng (không biến nạp gen) không có băng DNA. Có nghĩa là thí nghiệm được thực hiện chính xác.
+ Gen mã hóa cho invertase (ivr1) có trong tất cả các giống ngô tự nhiên vì thế có thể tìm thấy cả trong ngô không biến đổi gen (M) lẫn ngô biến đổi gen (T) nhờ cặp primer đặc hiệu của gen ivrl. Điều đó có nghĩa là DNA đã tồn tại ở cả hai loại ngô. + Với sự tham gia của 4 cặp primer (oligonucleotide) khác chúng đã khuếch đại những đoạn khác nhau của vector, một đoạn DNA được tạo ra chỉ ở ngô biến đổi gen (chỉ có T). Điều đó có nghĩa là cặp nucleotide đặc hiệu với DNA biến nạp và qua đó cho phép xác định chắc chắn giống ngô biến đổi gen.
Nói chung, phản ứng lai DNA và khuếch đại PCR đòi hỏi phải có những thông tin nhất định về DNA được biến nạp, vì thế cần có những mẫu dò hoặc những
nucleotide đặc hiệu.