IV. Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện của gen ngoại lai
5.3.Qui trình:
5. Phương pháp PCR
5.3.Qui trình:
Hình 3.18: Phương pháp PCR. P1, P2 là mồi.
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
(1)Nhiệt độ tăng lên 94-960C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là nóng chảy, nó phá vỡ cầu nối hygrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 49
được biến tính và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn dính. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt nóng chảy 50o
C (45-600C). Nhiệt độ sai trong giai đoạn này dẫn đến đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
(3) Cuối cùng, DNA polymerase lắp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và làm việc dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA- polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại.
Một ví dụ về sử dụng PCR để xác định cây biến đổi gen trong minh họa ở hình 3.19. (Zhu B, Ma BL, Blackshaw RE., 2010) [53].
Hình 3.19 : Xác nhận thay đổi gen ở ngô biến đổi gen.
Agarose gel với các đoạn DNA đƣợc phân tách sau khi thực hiện phản ứng PCR. Năm cặp primer đƣợc sử dụng (AmpR: gen kháng ampicillin, bar: kháng thuốc diệt cỏ, 35S bar: promoter và kháng thuốc diệt cỏ, cryIA: gen tạo độc tố ở Bt.. ivrl: gen mã hóa invertase ở ngô). M: DNA từ ngô bình thƣờng, T: DNA từ ngô biến đổi gen. Bên phải là marker chuẩn (SM) để xác định kích thƣớc của các đoạn PCR
Từ thí nghiệm trên có thể rút ra những kết luận sau:
+ Đối chứng (không biến nạp gen) không có băng DNA. Có nghĩa là thí nghiệm được thực hiện chính xác.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 50
+ Gen mã hóa cho invertase (ivr1) có trong tất cả các giống ngô tự nhiên vì thế có thể tìm thấy cả trong ngô không biến đổi gen (M) lẫn ngô biến đổi gen (T) nhờ cặp primer đặc hiệu của gen ivrl. Điều đó có nghĩa là DNA đã tồn tại ở cả hai loại ngô. + Với sự tham gia của 4 cặp primer (oligonucleotide) khác chúng đã khuếch đại những đoạn khác nhau của vector, một đoạn DNA được tạo ra chỉ ở ngô biến đổi gen (chỉ có T). Điều đó có nghĩa là cặp nucleotide đặc hiệu với DNA biến nạp và qua đó cho phép xác định chắc chắn giống ngô biến đổi gen.
Nói chung, phản ứng lai DNA và khuếch đại PCR đòi hỏi phải có những thông tin nhất định về DNA được biến nạp, vì thế cần có những mẫu dò hoặc những
nucleotide đặc hiệu.
6. Hệ thống gen chỉ thị và chọn lọc :
Để xác định những cây được biến nạp người ta sử dụng hệ thống gen chọn lọc. Đặc biệt là hệ thống chọn lọc trội, có nghĩa là chỉ những cây biến đổi gen có thể tái sinh và phát triển. Ngược lại, ở một hệ thống chỉ thị đơn giản như hệ thống chỉ thị GUS, thì cả những cây không biến nạp cũng tái sinh. Dĩ nhiên phương pháp này không hiệu quả, vì luôn luôn chỉ có một phần nhỏ tế bào thực vật được biến nạp. Một ưu điểm thứ hai quan trọng hơn là thao tác của hệ thống chọn lọc đơn giản để có thể phân tích nhanh một số lượng cây lớn.
Trong nhiều trường hợp người ta sử dụng kháng sinh kanamycin cho chọn lọc trội. Tuy nhiên, ở nồng độ cao nó độc đối với phần lớn thực vật. Điển hình cho kháng sinh nhóm này là một aminoalcohol gắn với gốc đường chứa nhóm amine
Hình 3.20: Công thức cấu tạo của Kanamycin
Bên cạnh kanamycin thu được từ Streptomyceskanamyceticus còn có
gentamycin (từ Micromonospora purpurea), neomycin (từ Streptomyces fradiae) và streptomycin (từ Streptomyces griseus) cũng thuộc nhóm này. Người ta sử dụng các gen kháng khác, ví dụ gen neomycin- phosphotransferase (nptII) mã hóa cho
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 51
kanamycin) do gắn thêm nhóm phosphate (phosphoryl hóa). Gen mã hóa cho neomycin-phosphotransferase có nguồn gốc từ vi khuẩn và thường không có trong thực vật. Với những promoter và terminator tương ứng, gen này có thể được sử dụng trong thực vật. Bên cạnh gen kháng kanamycin cũng có một loạt các hệ thống chọn lọc khác được sử dụng và giới thiệu ở bảng 3.1. (Bernard R. Glick & Jack J. Pasternak, 2007) [1].
Bảng 3.1. Hệ thống gen chỉ thị thực vật.
Các gen kháng trội, ngoài neomycin phosphotransferase, còn có hygromycin B phospho-transferase và 3-enolpyruvyl shikimate 5-phosphatsynthetase (EPSP- synthetase). Ngoài các gen chọn lọc, còn các gen chỉ thị (reporter gene) cũng được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp. Gen chỉ thị không chọn lọc trội, nhưng sản phẩm gen được chứng minh dễ dàng bằng phương pháp hóa sinh, hóa học mô, kính hiển vi hoặc quang kế.
Ví dụ: người ta có thể chứng minh chức năng của promoter đặc hiệu mô cũng như sự biến nạp của những loại tế bào nhất định hoặc để kiểm tra một gen xác định có hoạt động hay không. Trong thực vật bậc cao được sử dụng nhiều nhất là -D- glucuronidase, luciferase và mới đây là green fluorescent protein (GFP). Việc xác nhận được thực hiện nhờ sự biến đổi của một chất đặc hiệu (glucuronid hoặc luciferin) và sự phát hiện ra sản phẩm xúc tác hoặc quang tử trong trường hợp
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 52
luciferase. Ngược lại ở GTP-protein có thể chứng minh được bằng kính hiển vi huỳnh quang của protein sau khi kích thích với ánh sáng có độ dài bước sóng phù hợp. Ở phương pháp này không cần một cơ chất đặc hiệu.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.21: Xác nhận sự biểu hiện gen chỉ thị.
a: Xác nhận sự biểu hiện của luciferase, cơ chất là luciferin, phản ứng này phụ thuộc vào ATP. Ánh sáng tạo nên từ phản ứng đƣợc định lƣợng bằng máy.
b: Xác nhận sự biểu hiện của -D-glucuronidase, cơ chất nhân tạo là 5-bromo-4-chlor-3- indoyl- -glucuronid (X-GlcA), chất này đƣợc thủy phân nhờ glucuronidase. Bằng
sự oxy hóa xuất hiện một chất indigo màu xanh. Ngƣời ta có thể sử dụng các chất khác thay thế X-Glc, mà sản phẩm thuỷ phân là chất màu phát quang.
V. Phương pháp tái sinh cây .
So sánh với sinh vật đơn bào như vi khuẩn, nấm men hoặc tảo thì sự biến nạp vào thực vật bậc cao khó khăn hơn, vì không chỉ phải đưa DNA vào trong tế bào mà còn phải tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào hoặc mô phân lập. Điều này thực hiện được vì phần lớn tế bào thực vật có tính toàn năng và mỗi tế bào có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khác với động vật, thực vật có thể tái sinh từ tế bào soma
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 53
bình thường và từ đó thu được trực tiếp hạt biến đổi gen. Tuy nhiên, không phải tất cả các loại tế bào và mô đều phù hợp cho mục đích này. Vì vậy, ở thực vật phải thử nghiệm nhiều để tìm ra nguyên liệu sử dụng ban đầu phù hợp. Điều quan trọng là
Hình 3.22 : Bước tái sinh cây hoàn chỉnh
tìm ra môi trường phù hợp để kích thích tế bào phân chia. Bên cạnh những chất khoáng vô cơ, cần cả những chất hữu cơ khác nhau, đặc biệt đường là nguồn carbon và năng lượng, và các chất điều hoà sinh trưởng. Auxin và cytokinin có ý nghĩa lớn trong nuôi cấy mô và tế bào. Đôi khi amino acid hoặc nước dừa cũng được sử dụng. Cũng như ở trong cây tác dụng của phytohormone phức tạp và chức năng rất đặc hiệu.
Tuy nhiên có thể nói rằng, lượng cytokinin cao kích thích sự tạo chồi, nồng độ auxin cao, phụ thuộc với hàm lượng cytokinin, kích thích tạo callus hoặc rễ. Callus là một khối tế bào không màu, có kích thước lớn, không phân hóa và chứa không bào. Khi bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy callus thì sự phát triển chồi và rễ được kích thích trở lại. Điều kiện chính xác cho sự tái sinh thành công phải được thử nghiệm cho từng loài cây.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 54
Ví dụ: để tạo callus và chồi từ mảnh lá thuốc lá thì cần bổ sung 0,2 mg/l -NAA và 1,0 mg/l BAP (Hình 1.14).Từ tế bào trần có thể tái sinh cây hoàn chỉnh, nếu thành công ở bước tạo thành tế bào và phân chia tế bào. Tuy nhiên, ở nhiều thực vật quá trình tái sinh này rất khó khăn. Dĩ nhiên, ở cây tái sinh có sự biến đổi lớn về kiểu hình và nguyên nhân là do sự bất thường ở phân bào nguyên nhiễm và đột biến, được gọi là biến dị soma. Như đã nêu không phải tất cả thực vật được tái sinh dễ dàng từ tế bào trần, tế bào hoặc mô. Những loài đại diện của họ cà, cây cải cây, cam, táo và cà rốt tái sinh dễ dàng. Ở những thực vật khác rất hiếm hoặc chỉ thành công với một số giống nhất định (như củ cải đường). Đặc biệt khó khăn là các cây ngũ cốc. Trong thực tế các thí nghiệm biến nạp, sự tái sinh và sự chọn lọc thường được tiến hành đồng thời.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 55
Chƣơng 4 : NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU ĐỤC THÂN
TỪ B. THURINGIENSIS KURSTAKI.