IV. Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện của gen ngoại lai
1.Southern blot
Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gene, hay những DNA kích thước nhỏ hơn DNA plasmid, phage…
Cơ sở : kĩ thuật chuyển DNA từ gel lên màng lai.
Đầu tiên, DNA được phân tách trên gel agarose và được tách thành dây đơn (sử dụng muối có nồng độ cao để biến tính) để chuyển từ gel lên màng lai.
• Cách tiến hành:
Hình 3.14 : Cách tiến hành phương pháp Southern blot.
1. DNA mẫu; 2. Điện di trên gel agarose; 3. Chuyển DNA lên màng lai; 4. DNA cố định trên màng lai; 5. DNA cố định trên màng lai đƣợc lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ; 6. Phát hiện phân tử lai bằng phóng xạ tự ghi.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 44
1.DNA bộ gene được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bởi enzyme cắt giới hạn điện di để phân tách.
2.DNA được biến tính ngay trên gel chuyển lên màng lai (vị trí các đoạn DNA được giữ nguyên).
3.Tiến hành lai với mẫu dò có đánh dấu (phóng xạ, hóa học…) 4.Tiến hành rửa loại bỏ mẫu dò không bắt cặp đặc hiệu 5.Phát hiện tín hiệu lai.
• Ứng dụng:
- Lập bản đồ giới hạn của gene
- Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm trên gene.
Phản ứng lai Southern blot được sử dụng nhiều, vì nó ít nhạy cảm với sự lẫn tạp của DNA khác và đồng thời người ta nhận được thông tin về số lượng copy, nghĩa là số lượng phân tử DNA ngoại lai đựợc gắn vào hệ gen. Để thực hiện phương pháp này chỉ cần vài g DNA (1 g =1/1000 mg), mà người ta dễ dàng tách ra từ một lá cây duy nhất. Một ví dụ chứng minh cho DNA biến nạp đưa ra ở hình 3.15
Hình 3.15: Phóng xạ tự ghi kết quả lai Southern Blot.
Bộ gen của thực vật biến đổi gen được cắt bằng enzymegiới hạn và các đọan DNA được phân tách ra bằng điện di. Sau đó thực hiện Southern blot và lai với mẫu dò đánh dấu phóng xạ.
Các đường 1, 3 và 5: các nguyên liệu không biến nạp .
Mẫu ở các giếng 2, 4, 6 và 7: thể hiện các sinh vật biến đổi gen, vì ở đây xuất hiện tín hiệu lai rõ rệt.