III. Các phương pháp chuyển gen thường sử dụng ở thực vật
1.Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen
Đây là phương pháp phổ biến được áp dụng thành công để chuyển gen trực tiếp vào thực vật. Nguyên tắc là phải tạo một luồng khí để đẩy các viên đạn có kích thước nhỏ mang các gen mong muốn với V= 1300m/s xuyên qua các lớp tế bào, mô để xâm nhập vào bộ gen thực vật. Gen cần chuyển được kết tủa trên bề mặt vi đạn bằng CaCl2. Ưu điểm của phương pháp này là có thể chuyển gen vào nhiều đối tượng ( tế bào, mô, mô sẹo), tần xuất thành công khá cao (ở cây một lá mầm). Hơn nữa việc thiết kế vector khá đơn giản. Tuy nhiên khi tái sinh cây lại dễ bị thể khảm.
Hiện nay người ta đã chế tạo ra nhiều loại súng bắn gen mới, hiện đại (Sautter, 1991; Finter ở đại học Ohio của Mỹ). Những năm gần đây, ở Việt Nam nhiều tác giả thuộc viện CNSH, viện di truyền, viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cũng đã sử dụng súng bắn gen Corb – PIG vào mô sẹo các plasmid pMOW, PRQ6 mang gen kháng rầy, chống nấm bạc lá lúa thu được nhiều dòng lúa chuyển gen có nhiều đặc tính tốt.
Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6x7x10 nối với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm .Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 36
chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 37
Hình 3.11: Sơ đồ chuyển gen bằng súng bằng gen.
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnh và tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp.
Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 38
tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới.