II. Các vector sử dụng để chuyển gen vào thực vật
3. Vector Ti-plasmid cải tiến
3.1. Hệ thống vector đồng liên hợp
Người ta đã thành công trong việc làm biến đổi Ti-plasmid và T-DNA để những phytohormone này không được tạo nên. Trong những bước tiếp theo gen tổng hợp opine được cắt ra và đưa vào đó những gen chọn lọc , ví dụ gen kháng kanamycin. Ngày nay, người ta sử dụng những hệ thống được gọi là vector liên hợp ở đây chức năng của Ti-plasmid được thực hiện ở hai plasmid.
Hình 3.9: Sơ đồ biểu diễn hệ thống vector hai nguồn để biến nạp bằng A. tumefaciens.
Các gen tạo khối u và tổng hợp nopalin đƣợc loại ra, T-DNA mang một gen đánh dấu để chọn lọc trong thực vật (SMG). Các gen khác đƣợc chèn vào. A. t. ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong A. tumefaciens, E. c. ori: Khởi đầu sao chép để nhân lên trong E. coli. kanR: gen kháng kanamycin để chọn lọc trong E.coli và A. tumefaciens. P1, P2: Promoter, T1, T2: Terminator, vir: Vùng vir.
Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid
Ti-plasmid không có T- DNA v i r A.t. ori LB T2 Gen P2 T1 SMG P1 RB Mod. T-DNA R B L B KanR E. coli plasmid với T-DNA E.coli oli
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 35
tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium. Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmid trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) nên vector này ít được sử dụng.
3.2.Hệ thống vector kép
Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ E.coli trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu.