IV. Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện của gen ngoại lai
4.ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (EnzymeImmuno Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzymesẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN- KT. Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiến (polystyrene microtiter plate). Protein tạp Protein tạp Protein tạp Protein đích Protein tạp Màng lai Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi Kháng thể
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 47
- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa; - Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
KT đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN có thể xảy ra. Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzymelàm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn KT liên kết với KN được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzymeliên kết với KT trong phức hợp KT-KN. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ xảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA.