III. Các phương pháp chuyển gen thường sử dụng ở thực vật
5.Kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn (polen tuber)
Phương pháp này còn được xem là phương pháp chuyển không qua nuôi cấy mô. Chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn được nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếp theo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của hai tác giả Trung Quốc Duan và Chen (1985).
Đây là phương pháp lợi dụng ống phấn để chuyển vector mang gen đi cùng tế bào sinh dục đực (tinh tử) để kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang gen ngoại lai được chuyển vào. Sau đó, hợp tử sẽ phát triển thành hạt. Hạt nảy mầm và phát triển thành cây chuyển gen và được di truyền cho các thế hệ sau.
Chuyển gen qua ống phấn tốt nhất thực hiện ngay sau khi quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn, nhưng tế bào sinh dục cái chưa kịp phân chia. Nếu làm được như vậy sự chuyển gen sẽ được thực hiện đối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và sau khi tái sinh cây sẽ tránh xuất hiện thể khảm. Trong thí nghiệm của Ray Wu, tỷ lệ hạt chuyển gen/hạt thí nghiệm là 20%.
Quy trình trên cây lúa:
1. Lúa trồng trong chậu với các điều kiện nước, phân, nhiệt độ, chiếu sáng thích hợp. Khi lúa trỗ, chọn các hoa có hai vỏ trấu mở hoàn toàn và đánh dấu để khỏi nhầm lẫn với các hoa khác.
2. Dùng một kéo sắc cắt bỏ 2/3 đến 3/4 phần trên của hoa. Vòi nhị cái như vậy cũng bị cắt ngắn.
3. Dùng một ống mao quản (đường kính trong 0.2mm) đặt vào chỗ cắt 2-3 µl dung dịch ADN nồng độ 50 µg/ml, trong đệm TE.
4.Bao bông lúa đã thành thục. Thường sau đó bảo quản ở 4oC. 5.Gieo hạt tạo cây và xác định sự có mặt của gen ngoại lai.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 43
Chú ý: Cần cắt hoa lúa sao cho không làm tổn thương bầu nhị, nhưng chỗ cắt trên vòi nhị cái phải tương đối gần với noãn để ADN có thể xâm nhập dễ dàng. Thời gian hoa nở đến lúc cắt phải đủ để hạt phấn nảy mầm, phát triển qua vòi nhị và thụ tinh. Thường khoảng 1-2 giờ.
Về nguyên tắc phương pháp này có thể áp dụng cho nhiều loại cây không chỉ ở lúa. Ở Việt Nam, phương pháp này đang được Viện nghiên cứu cây bông và Viện CNSH thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông.