II. Các vector sử dụng để chuyển gen vào thực vật
2.Ti – plasmid
2.1. Cấu tạo Ti-plasmid.
Việc sử dụng A. tumefaciens đã bắt đầu từ 1907, khi người ta phát hiện vi khuẩn này có khả năng tạo nên khối u ở cây hai lá mầm bị thương, được gọi là khối u cổ rễ. Trong những năm bảy mươi người ta tìm thấy trong các chủng
A. tumefaciens tạo khối u có một plasmid rất lớn có kích thước 200 đến 800 kb. Qua những thí nghiệm chuyển đến những chủng không độc (không có plasmid này), đã khẳng định plasmid này cần thiết cho việc tạo khối u. Vì vậy, plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor inducing-plasmid).
Ti-plasmid là một plasmid lớn với kích thước khoảng 200kb. Trên Ti-plasmid có đoạn T-DNA (tumor DNA) được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. Các bờ này gồm một trình tự lặp lại của 25 bp, là trình tự nhận biết cho việc cắt T-DNA. T-DNA là một đoạn có kích thước 25kb chứa các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây ra bệnh u. Ngoài T- DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng vir (vir region) chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp (conjugative transfer) và tiêu hóa opine (opine catabolism) và các gen gây khối u, tổng hợp và đồng hóa opine.
Ti - plasmid
T- DNA
Nhiễm sắc thể vi khuẩn
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 31
Hình 3.6: Cấu tạo của Ti-plasmid.
Phân tích di truyền và ứng dụng kỹ thuật lập bản đồ liên kết gen cho phép chúng ta hiểu được chức năng của vùng mang T-DNA, vùng này được thể hiện theo sự liên hợp nhất. T-DNA được đưa vào DNA thực vật trong nhân tế bào. Vị trí gắn vào thường là ngẫu nhiên, tuy nhiên thường là những vùng có khả năng sao chép. Sự tổng hợp opine được điều khiển bởi T-DNA. Những enzyme như: octopine synthase, nopaline synthase được mã hóa trên T-DNA tại những locus: osc và nos
theo thứ tự. Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u. Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng gen ipt kích thích cho sự hình thành cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin kích thích sự hình thành callus tạo lên các khối u.
2.2. Cơ chế chuyển gen của Ti-plasmid.
Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn như sau: khi cây bị thương tiết ra chất độc vết thương thường là các chất có bản chất phenol: acetosyringone (AS) và hydroxyacetosyringone (OH-AS). Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập, chất có vai trò quan trọng trong việc nhận biết và sự gắn kết giữa vi khuẩn và tế bào thực vật lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào bộ gen thực vật. Cơ chế nhận biết được giải thích là nhờ tính đặc hiệu của A.tumefaciens với cây hai lá mầm, ở cây một lá mầm thì phản ứng này chỉ ở một ít loài. Vì vậy, Agrobacterium được sử dụng giới hạn cho biến nạp cây một lá mầm.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 32
A. tumefaciens nhận biết acetosyringon nhờ một chất nhận, được mã hóa bằng một gen ở vùng vir. Sự nhận biết bằng chất nhận dẫn đến sự hoạt hóa của tất cả gen
vir. Vùng vir bao gồm nhiều gen. Một sản phẩm gen vir khác là một endonuclease nhận biết bờ phải và trái của T-DNA và cắt T- DNA ở những vị trí này. Sau đó, một protein gắn vào sợi đơn của T-DNA và phức hệ này được chuyển vào thực vật dưới tác dụng của các sản phẩmgen vir .
Hình 3.7: Quá trình tạo phức hợp T-DNA- protein.
1: T- DNA với bờ phải và bờ trái đƣợc chèn vào Ti-plasmid. 2: Sợi đơn đƣợc cắt ra nhờ protein đƣợc mã hóa bởi gen virD2. 3: Sợi đơn của T-DNA đƣợc giải phóng và kết hợp với protein do virD2 và virE2 mã hóa, chỗ đứt ở sợi đơn thứ hai đƣợc tổng hợp bổ sung. 4: Lấp đầy chỗ trống trong Ti-plasmid (đƣờng gạch nối đậm). Sợi T-DNA tự do đƣợc vận chuyển vào tế bào thực vật ở dạng phức hệ DNA-protein.
Sau đó T-DNA duỗi mạch và liên kết với các protein gây khối u tạo thành phức hợp DNA – protein. Phức hợp này thông qua vết thương xâm nhập vào tế bào thực vật. Khi xâm nhập vào tế bào thực vật, protein kích thích hình thành khối u tách ra khỏi phức hợp còn T-DNA gắn vào bộ gen thực vật.
T-DNA RB RB LB Phức hệ T-DNA-Protein Ti- plasmid T-DNA Protein gây khối u endonucleas e
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 33
Hình 3.8: Minh họa cơ chế hoạt động của Ti-plasmid.
Khối u được tạo nên là do phytohormone (auxin và cytokinin) được tạo ra ở trong tế bào thực vật bị xâm nhiễm, chúng kích thích sự phân chia tế bào và tạo nên mô không phân hóa.
Sự phát triển khối u sau khi nhiễm A. tumefaciens dựa trên tác dụng của hai phytohormone. Các enzyme cần thiết cho tổng hợp phytohormone được mã hóa chủ yếu từ những gen trên T-DNA. Sự tổng hợp auxin được thực hiện bởi hai gen là
tms1 và tms2. Gen tms1 mã hóa tryptophan-2- monooxygenase xúc tác cho sự biến đổi tryptophan thành indol-3-aceamid. Sản phẩm của gen tms2 là indol-3-acetamid- hydrogenase, xúc tác để tạo ra auxin: indolylacetic acid. Ngoài ra T-DNA còn mang gen tmr mã hóa cho enzyme isopentenyltransferase. Enzyme này gắn 5’-AMP vào chuỗi bên isoprenoid để tổng hợp nên tiền cytokinin là isopentenyladenin và isopentenyladenosin. Hydroxyl hóa tiền cytokinin bằng những enzyme thực vật để tạo nên cytokinin. Auxin được tạo nên cùng với cytokinin làm cho khối u lớn lên, trong đó sự phân chia tế bào không phân hóa được kích thích. Quá trình này ứng dụng trong công nghệ gen gặp khó khăn do việc tạo mô do những gen tổng hợp cytokinin và auxin không thể tái sinh từ tế bào thành những cây hoàn chỉnh và khỏe mạnh. Sự tổng hợp opine là không mong muốn vì cây tiêu tốn năng lượng không cần thiết. DNA lạ không thể đưa vào Ti-plasmid cũng như T- DNA.
GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 34