II. Giới thiệu về ngô chuyển gen
3.4.Nhân dòng DNA tái tổ hợp
3. Các bước tạo giống ngô chuyển gen trong phòng thí nghiệm
3.4.Nhân dòng DNA tái tổ hợp
Nhân dòng DNA tái tổ hợp được thực hiện trong vi khuẩn E. coli, là vi khuẩn Gram âm, ngắn, di động, có hình que (chiều dài nhỏ hơn 1μm) thường thấy trong ruột người và không có trong đất hoặc nước. Ta chọn E.coli để nhân dòng DNA tái tổ hợp vì E.coli dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector.
Sau khi thiết kế vector tái tổ hợp mang gen độc tố B. thuringiensis, vector này được biến nạp vào E.coli bằng phương pháp hóa biến nạp. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là phức hợp DNA – calcicum dễ được tế bào thu nhận qua cơ chế thực bào. Quy trình thực hiện như sau: tế bào E.coli ban đầu được ngâm trong dung dịch CaCl2 đóng đá. Tiếp theo trộn DNA plasmid tái tổ hợp với các tế bào khả biến rồi ủ trong nước đá trong 20-30 phút. Sau đó tăng nhiệt độ đột ngột lên 420
C và giữ ở nhiệt độ đó trong 2 phút. Các tế bào đã được biến nạp ủ trong nước thịt dinh dưỡng ở 370C trong 1 giờ.
Chọn lọc tế bào E.coli có mang plasmid chứa gen độc tố B. thuringiensis
bằng môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh spectinomycine. DNA plasmid có gen kháng spectinomyxin nên tế bào nào nhận được DNA plasmid sẽ có khả năng phát triển trên môi trường có chứa spectinomyxin và ngược lại. Từ đó ta có thể chọn lọc và nhân lên các tế bào E.coli biến nạp có mang plasmid phục vụ cho công tác chuyển gen sau này.
Sau khi nhân dòng E.coli trong môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của E.coli (môi trường EC Broth), tiến hành phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng cách nghiền tế bào trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, sarcosyl) và
proteinase K. Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và mang nhân giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Để loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu như protein, ta thêm dung dịch phenol:
chloroform để làm biến tính protein, khi bị biến tính protein không hòa tan được trong nước. Sau ly tâm, protein sẽ bị tủa thành một lớp nằm giữa pha nước có chứa nucleic acid và pha phenol: chloroform. Ta thu lại pha nước có chứa nucleic acid. Hỗn hợp nhiều nucleic acid có tỉ trọng khác nhau đem siêu ly tâm trên gradient liên tục CsCl thu được plasmid có chứa gen độc tố diệt sâu.