Trong phƣơng pháp AdSV, các kỹ thuật sử dụng để ghi đƣờng von-ampe hòa tan là von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), von-ampe xung thƣờng (Normal Pulse - NP) và von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW), khi đó tên của
21
phƣơng pháp đƣợc gắn thêm tên của kỹ thuật đo, chẳng hạn nhƣ: Von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân DP-AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ xung thƣờng NP - AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông SW-AdSV. Phƣơng pháp NP -AdSV tỏ ra có nhiều ƣu điểm đối với một số chất hữu cơ, theo lý thuyết thì tín hiệu cƣờng độ dòng thu đƣợc trong phƣơng pháp NP - AdSV cao gấp khoảng 4 lần so với phƣơng pháp DP - AdSV. Von-ampe hòa tan sóng vuông thích hợp với các chất phân tích có đặc tính thuận nghịch. Nhìn chung, các chất hữu cơ có đặc tính điện hóa là bất thuận nghịch vì thế phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân thƣờng hay đƣợc áp dụng để nghiên cứu và định lƣợng cho các đối tƣợng nghiên cứu.
1.4.2.1. Kỹ thuật xung vi phân (DP)
Trong kỹ thuật xung vi phân, điện cực đƣợc phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với một tốc độ chậm nhƣng vào cuối mỗi chu kì xung trên khung điện áp biến đổi một chiều ngƣời ta đặt thêm một xung vuông góc với biên độ thay đổi từ 10 - 100mV và độ dài xung từ 40 - 100ms. Cƣờng độ dòng đƣợc ghi hai lần, lần 1 tại thời điểm i1, thƣờng là 17ms trƣớc khi nạp xung và lần hai là 17ms trƣớc khi cắt xung, lúc này ghi dòng cực phổ dƣới tác dụng của xung. Hai giá trị này đƣợc gửi vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó. Tín hiệu có dạng một cực đại.
1.4.2.2. Kỹ thuật xung thường (NP)
Trong kỹ thuật xung thƣờng, điện cực đƣợc phân cực bằng một điện áp 1 chiều chọn trƣớc và giữ không đổi trong suốt quá trình , gọi là thế khởi điểm hay thế nền tƣơng ứng với chân píc thu đƣợc. Tại một thời điểm xác định, điê ̣n cƣ̣c đƣợc phân cƣ̣c thêm mô ̣t xung da ̣ng vuông góc có thời gian tồn ta ̣i ngắn (40-100 ms), sau đó xung bi ̣ ngắt và thế điện cực trở về điện áp khởi điểm. Biên đô ̣ xung tăng dần theo thời gian với tốc độ đều. Cƣờng độ dòng đƣợc ghi tại một thời điểm, thƣờng 17ms trƣớc khi ngắt xung t(i).
1.4.2.3. Kỹ thuật sóng vuông
Theo kỹ thuật này, điện cực đƣợc phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên đều, đƣợc đặt chồng lên điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số từ 8 Hz
22
đến 2000 Hz, biên độ từ 1 đến 50 mV. Trong mỗi chu kỳ xung, dòng đƣợc đo hai lần: thời điểm 1 (dòng dƣơng I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2). Dòng thu đƣợc là hiệu của hai giá trị dòng đó (Ip = I1 - I2) và Ip là hàm của thế áp vào điện cực làm việc và nồng đô ̣ chất khảo sát [68]. Đối với các chất có tính thuận nghịch thì kỹ thuật hòa tan sóng vuông có độ nhạy cao hơn kỹ thuật xung vi phân.
1.4.3. Các yếu tố cần khảo sát khi xây dựng một quy trình phân tích theo phƣơng pháp AdSV phƣơng pháp AdSV
Khi nghiên cứu tính chất điện hóa của một chất bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan thì phƣơng pháp von-ampe vòng rất hiệu quả trong việc nghiên cứu khả năng hấp phụ và các đặc tính điện hóa của một chất. Dựa trên đƣờng von-ampe vòng có thể cho phép lý giải đƣợc các quá trình điện hóa xảy ra, đó là quá trình oxy hóa hay quá trình khử, các píc thuận nghịch hay bất thuận nghịch, thế đỉnh píc xuất hiện trong khoảng thế nào. Từ đó lựa chọn đƣợc các loại điện cực có thể sử dụng để xác định chất đó.
Một phƣơng pháp khác đƣợc sử dụng để làm sáng tỏ tính chất hấp phụ đã đƣợc chúng tôi áp dụng đó là phƣơng pháp tổng trở. Tuy nhiên do hạn chế về thiết bị đo điện hóa, chúng tôi không đo đƣợc phổ tổng trở trên điện cực HMDE, chỉ đo đƣợc phổ tổng trở trên điện cực than gƣơng (GCE).
Để định lƣợng hàm lƣợng các hoạt chất trong mẫu thực tế bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ, trƣớc hết phải lựa chọn đƣợc điện cực làm việc và kỹ thuật ghi đo đƣờng hòa tan sao cho phù hợp với mục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm. Tiếp theo là khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến tín hiệu hòa tan ghi đƣợc. Các yếu tố cần khảo sát bao gồm:
1).Thành phần dung dịch nền, pH:Đây là những yếu tố có quan hệ chặt chẽ với nhau và chúng quyết định độ dẫn điện của nền, dạng tồn tại và khả năng hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt điện cực, tức là ảnh hƣởng đến động học của quá trình làm giàu cũng nhƣ quá trình hòa tan, điều đó có nghĩa ảnh hƣởng đến cƣờng độ dòng, thế đỉnh píc và độ phân giải đỉnh píc.
23
có hoạt tính điện hóa và có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực trong những môi trƣờng nhất định. Tuy nhiên, không phải chất hữu cơ nào có hoạt tính sinh học cũng có hoạt tính điện hóa và không phải chất hữu cơ nào cũng có khả năng hấp phụ trên điện cực. Mặt khác, có những chất có hoạt tính điện hóa trực tiếp, có những chất phải gián tiếp thông qua phản ứng kiềm hóa, axít hóa mới có hoạt tính điện hóa và dựa vào đó mới có thể định lƣợng đƣợc.
2) Thế tích lũy, thời gian tích lũy, nhiệt độ và các điều kiện thủy động học trong quá trình tích lũy nhƣ tốc độ khuấy (tốc độ quay cực), thời gian cân bằng...là những yếu tố quyết định đến hiệu quả quá trình tích lũy, do chúng tác động đến sự chuyển khối, động học hấp phụ điện hóa và dẫn đến ảnh hƣởng giá trị cƣờng độ dòng và thế đỉnh píc. Trong nghiên cứu tính chất điện hóa, dựa vào kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thế tích lũy, thời gian tích lũy, nhiệt độ sẽ lý giải đƣợc các quá trình điện hóa xảy ra.
3) Các thông số kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan nhƣ biên độ, tần số, khoảng quét thế, bƣớc thế, tốc độ quét...các thông số đó ảnh hƣởng đến độ dốc của đƣờng nền và độ lớn của tín hiệu hòa tan cũng nhƣ độ phân giải đỉnh píc.
4). Các chất cản trở
- Các chất có thế đỉnh píc lân cận hoặc trùng với thế đỉnh píc của chất nghiên cứu. - Các chất hoạt động bề mặt có thể bị hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc và do vậy làm cản trở quá trình tích lũy của chất nghiên cứu lên bề mặt điện cực đó.
Sau khi lựa chọn đƣợc các điều kiện tối ƣu, cần đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp nghiên cứu thông qua phép đo độ lặp lại, độ đúng, độ nhạy, độ chụm, khoảng tuyến tính và giới hạn phát hiện của phƣơng pháp.
1.4.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu dịch sinh học trong phân tích von-ampe hòa tan
Mẫu dịch sinh học là đối tƣợng mẫu phức tạp, cần phải xử lý mẫu trƣớc khi định lƣợng. Thông thƣờng có 3 phƣơng pháp xử lý mẫu dịch sinh học đó là phƣơng pháp tạo kết tủa, phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng và phƣơng pháp chiết pha rắn (lỏng - rắn). Tùy thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu, điều kiện phòng thí nghiệm mà lựa chọn cách xử lý mẫu cho phù hợp [14, 62].
24
Qua tổng quan tài liệu [75], nicardipin là thuốc điều chỉnh huyết áp, có công thức cấu tạo tƣơng tự nhƣ nifedipin, ngƣời ta đã xác định nicardipin trong mẫu nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp AdSV, trƣớc khi cho vào đo, mẫu nƣớc tiểu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp kết tủa bởi ZnSO4 trong môi trƣờng kiềm.
Nhóm tác giả Ozatin, Yardimci, Ceren [79] đã xử lý mẫu huyết tƣơng để xác định nifedipin theo quy trình: Bơm nifedipin chuẩn vào 1ml mẫu huyết tƣơng của ngƣời không uống thuốc (không có nifedipin) thêm 0,1ml Na2S2O5và 0,2 ml NaOH 1M vào hỗn hợp dung dịch, lắc 30s. Thêm 5ml n-hexan - diclometan (7/3: v/v), lắc 1 phút, sau đó li tâm 10 phút với tốc độ 3000rpm, lớp hữu cơ đƣợc chuyển vào ống và làm bay hơi dƣới dòng nitơ, sau đó phần còn lại đƣợc hòa tan bằng 0,5ml metanol: nƣớc (1:2), thêm chất điện li, định mức dung dịch và cho vào bình điện phân và tiến hành đo bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan. Hiệu suất thu hồi khi bơm nifedipin vào trong mẫu huyết tƣơng đạt từ 96,26 % đến 99,49%.
Hiện nay, kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) hay đƣợc sử dụng để tách và làm giàu chất phân tích [12, 102, 111]. Đối với mẫu sinh hóa nhƣ mẫu nƣớc tiểu và mẫu huyết tƣơng thì cột chiết đƣợc sử dụng trong quá trình tách thƣờng là cột C-18 (pha tĩnh) [52], pha động thƣờng là các dung môi hữu cơ nhƣ metanol, acetonitril - metanol, aceton. Theo tài liệu [16, 33, 71], nifedipin sau khi đi qua cột C-18 đƣợc rửa giải bằng aceton, loại aceton bằng dòng khí nitơ.
Qua tham khảo tài liệu chƣa tìm thấy quy trình xử lý mẫu nƣớc tiểu để xác định amlodipin besylat và cephalexin bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ. Tuy nhiên, dựa vào các tài liệu về sắc ký thấy rằng cephalexin đƣợc tách trong cột sắc ký C-18 với thành phần pha động là acetonitril - metanol - đệm acetat hoặc acetonitril - metanol - dung dịch kalidyhidrophotphat - nƣớc. Đây là cơ sở để tiến hành khảo sát các điều kiện khi xử lý mẫu theo phƣơng pháp chiết pha rắn.
Một số kết luận rút ra từ phần tổng quan:
Hai dòng thuốc tim mạch (nifedipin, amlodipin besylat) và kháng sinh họ cephalosporin (cephalexin thế hệ 1) là những thuốc đƣợc sử dụng khá phổ biến ở nƣớc ta. Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để định lƣợng chúng có thể đƣợc áp dụng
25
là nhóm phƣơng pháp sắc ký, phƣơng pháp trắc quang và phƣơng pháp điện hóa (phƣơng pháp cực phổ, phƣơng pháp von-ampe hòa tan). Phƣơng pháp thƣờng quy đƣợc đề cập trong dƣợc điển để định lƣợng các hoạt chất trên là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), riêng nifedipin khi định lƣợng thuốc dạng bào chế có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn độ. Tuy nhiên, đối với mẫu dịch sinh học, hàm lƣợng thuốc trong đó là rất nhỏ thì phƣơng pháp chuẩn độ và phƣơng pháp trắc quang không thể áp dụng đƣợc, trong khi đó phƣơng pháp HPLC thì cần thiết bị tƣơng đối đắt tiền, chi phí cho quá trình phân tích cao. Vì vậy, việc nghiên cứu các điều kiện điện hóa để định lƣợng chúng bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan có ý nghĩa khoa học và thực tiễn góp phần đa dạng hóa phƣơng pháp, có thể kiểm tra song hành với phƣơng pháp thƣờng quy trong dƣợc điển.
Trên thế giới, các thuốc trên đã đƣợc nghiên cứu và xác định bằng phƣơng pháp cực phổ, phƣơng pháp von-ampe hòa tan, tuy nhiên các đặc tính hấp phụ chƣa đƣợc lý giải, đối tƣợng áp dụng chủ yếu là mẫu thuốc dạng bào chế hay dạng viên nén. Ở Việt nam, chƣa có công trình nào nghiên cứu tính chất điện hóa của ba hoạt chất trên bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tính chất điện hóa và ứng dụng trong phân tích là cần thiết và có ý nghĩa.
26
CHƢƠNG 2: NÔI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Mục tiêu của luận án là nghiên cứu tính chất điện hóa của nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) và điện cực than gƣơng (GCE). Ứng dụng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ để xác định hàm lƣợng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin trong mẫu thuốc và mẫu nƣớc tiểu. Vì đối tƣợng mẫu nƣớc tiểu phức tạp, nên việc nghiên cứu các điều kiện chiết tách các tạp chất bằng kỹ thuật chiết pha rắn và phƣơng pháp kết tủa đã đƣợc đề cập. Để thực hiện mục tiêu đó, luận án tập trung vào các nô ̣i dung nghiên cứu cụ thể sau:
1) Nghiên cứu tính chất điện hóa của nifedipin trên HMDE bằng phƣơng pháp von- ampe vòng, phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân và phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung thƣờng.
2) Nghiên cứu tính chất điện hóa của nifedipin trên điện cực GCE bằng phƣơng CV, phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân và phƣơng pháp tổng trở.
3) Nghiên cứu tính chất điện hóa của amlodipin besylat trên điện cực GCE bằng phƣơng CV, phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân và phƣơng pháp tổng trở.
4) Nghiên cứu tính chất điện hóa của cephalexin trên HMDE bằng phƣơng pháp von-ampe vòng và phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân.
5) Ứng dụng phƣơng pháp von-ampe hòa tan để xác định hàm lƣợng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin trong mẫu thuốc và mẫu nƣớc tiểu:
- Xây dựng sơ đồ xác định nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin trong mẫu thuốc bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ.
- Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu nƣớc tiểu , xây dựng sơ đồ xác định nifedipin, amlodipin và cephalexin trong mẫu nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ.
- Áp dụng phân tích hàm lƣợng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin trong một số mẫu nƣớc tiểu của bệnh nhân sử dụng thuốc
27
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tiến trình thí nghiệm theo phƣơng pháp CV
Các thí nghiệm đo đƣờng von-ampe vòng đƣợc ghi trong một khoảng thế rộng nhất định trong hai trƣờng hợp ghi trực tiếp (tacc = 0s) và có tích lũy (tacc = 30s), xác định giá trị Ip và Ep của tín hiệu thu đƣợc. Tất cả các thí nghiệm đƣợc tiến hành ở nhiệt độ phòng, thƣờng là 250C. Riêng đối với điện cực GCE trƣớc khi đo phải đánh bóng bề mặt điện cực bằng miếng nhung the và bột nhôm oxít (kích thƣớc 0,2µm) đến khi sáng bóng nhƣ gƣơng mới sử dụng.
- Ghi đƣờng CV trực tiếp: Cho dung dịch cần nghiên cứu vào bình điện phân (hệ 3 điện cực), loại oxy bằng khí nitơ với thời gian 300s, sau đó ghi đƣờng hòa tan một vòng trong khoảng thế nhất định, quan sát sự xuất hiện píc trên đƣờng phân cực catot và trên đƣờng phân cực anot, xác định các thông số đặc trƣng của đƣờng CV. - Ghi đƣờng CV hòa tan hấp phụ:
+ Bƣớc 1: Tích lũy chất trên bề mặt điện cực HMDE hoặc điện cực GCE tại một thế tích lũy trong một khoảng thời gian nhất định. Trong giai đoạn này dung dịch đƣợc khuấy bởi một thanh khuấy với tốc độ không đổi, chất nghiên cứu đi đến bề mặt điện cực, hấp phụ trên bề mặt điện cực đó.
+ Bƣớc 2- cân bằng: Kết thúc giai đoạn tích lũy, dung dịch đƣợc ngừng khuấy, thời gian cân bằng 5s để chất phân bố đồng đều trên bề mặt điện cực.
+ Bƣớc 3- hòa tan: Kết thúc giai đoạn cân bằng, ghi đƣờng hòa tan một vòng hoặc đa vòng trong một khoảng thế nhất định. Quan sát sự xuất hiện píc trên đƣờng phân cực catot và anot, xác định các giá trị đặc trƣng nhƣ thế đỉnh píc, cƣờng độ dòng píc. Lý giải các quá trình xảy ra dựa vào đƣờng CV [47].
Ghi đƣờng CV của mẫu trắng (nền) là mẫu có thành phần tƣơng tự nhƣ dung dịch nghiên cứu, nhƣng không chứa chất nghiên cứu (nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin) - cũng đƣợc ghi tƣơng tự nhƣ trên và thƣờng đƣợc ghi trƣớc trong bất kỳ nghiên cứu nào. Toàn bộ quá trình ghi đƣờng CV và xác định Ep và Ip đƣợc thực hiện trên thiết bị phân tích điện hóa Autolab µA III (Hà Lan) kết nối với VA Stand 663 (Metrohm, Thụy Sĩ), bình điện hóa là hệ 3 điện cực.
28
2.2.2. Tiến trình thí nghiệm theo phƣơng pháp DP-AdSV
Bƣớc 1- tích lũy chất: Cho dung dịch gồm chất nghiên cứu, nền vào bình điện hóa, sau giai đoạn sục khí N2 để loại oxy là giai đoạn tích lũy chất lên bề mặt điện cực tại thế tích lũy với thời gian tích lũy nhất định. Thế tích lũy là thông số quan trọng, ảnh hƣởng nhiều đến cƣờng độ dòng nên cần đƣợc nghiên cứu khảo sát trƣớc tiên để chọn thế thích hợp.
Bƣớc 2- cân bằng: Sau thời gian tích lũy chất có khuấy là thời gian cân bằng