- Cân chính xác 200mg C18 (Lichrosorb RP-18), kích thƣớc hạt 10µm (Merck), đƣợc nhồi vào cột chiết pha rắn có thể tích 3ml, đƣợc cố định hai đầu bằng miếng frit (nhựa polyetylen xốp). Trƣớc khi sử dụng, hoạt hóa cột chiết bằng 4 ml metanol khoảng 30 phút, sau đó rửa cột bằng nƣớc cất hai lần.
2.2.8.2. Quy trình xử lý mẫu nước tiểu xác định nifedipin bằng SPE
Các điều kiện thích hợp để chiết tách lấy nifedipin nhƣ chất rửa giải, pH, nồng độ, thể tích, tốc độ chảy đều đƣợc nghiên cứu. Lựa chọn các điều kiện rồi đƣa ra quy trình xác định nhƣ sau.
32
Lấy 2ml mẫu nƣớc tiểu đi qua cột với tốc độ chảy 0,7ml/phút, nifedipin và tạp chất bị giữ trên cột, tiền rửa giải bằng 5ml đệm Britton - Robinson (BR) pH = 7,0 và 4 ml aceton : nƣớc (1:5 theo v/v), lúc này các tạp chất đƣợc rửa ra trƣớc chỉ còn lại nifedipin trên cột, sau đó rửa giải nifedipin bằng 2ml aceton, loại ảnh hƣởng của dung môi bằng cách cho bay hơi khô dƣới dòng nitơ (còn lại khoảng 0,2ml), thêm 10ml đệm BR có pH = 4,0, cho dung dịch vào bình 25ml và định mức đến vạch bằng nƣớc cất 2 lần. Cho dung dịch vào bình cực phổ và tiến hành đo bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ catot sử dụng điện cực HMDE và điện cực GCE. Xác định hiệu suất thu hồi bằng phƣơng pháp thêm chuẩn nifedipin vào trong mẫu nƣớc tiểu và tiến hành xử lý tƣơng tự theo quy trình trên.
2.2.8.3. Quy trình xử lý mẫu nước tiểu xác định cephalexin bằng SPE
Cho 1ml mẫu nƣớc tiểu đi qua cột với tốc độ chảy 0,7ml/phút, rửa giải lấy cephalexin bằng 2ml hỗn hợp acetonitril - metanol - đệm acetat pH = 4,5 theo tỉ lệ 10 : 10 : 80. Lấy phần dịch chiết đó, thêm 2,5ml NaOH 2M, thêm một ít nƣớc cất hai lần, đun cách thủy ở 900C trong 20 phút. Lấy ra, để nguội định mức vào bình 25ml và tiến hành đo với các điều kiện: Eacc = -0,3V, tacc = 30s, Erange = -0,3V ÷ - 1,5V, tốc độ quét 12,5mV/s, hàm lƣợng cephalexin đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn cephalexin vào trong mẫu nƣớc tiểu và tiến hành tƣơng tự.
Kết thúc quá trình chiết rửa giải, cột chiết đƣợc tái sinh bằng cách cho acetonitril đi qua, sau đó cho 4 ml metanol đi qua cột với tốc độ 0,5ml/ phút, cuối cùng rửa lại bằng nƣớc cất.
2.2.9. Xử lý mẫu nƣớc tiểu theo phƣơng pháp kết tủa
2.2.9.1. Quy trình xử lý mẫu nước tiểu xác định nifedipin
Lấy 2ml mẫu nƣớc tiểu, thêm 1ml etanol 95% + 1ml NaOH 0,2M + 1ml ZnSO4 5% vào lắc đều và li tâm hoặc lọc qua giấy lọc 0,45µm. Sau đó, lấy 2ml dung dịch sau khi lọc cho vào bình định mức 25ml (hoặc 50ml khi sử dụng điện cực than gƣơng), thêm 10 ml dung dịch đệm pH = 4,0, định mức đến vạch, cho vào bình điện hóa và tiến hành đo bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi
33
phân và xung thƣờng. Hàm lƣợng nifedipin trong mẫu đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn nifedipin vào mẫu nƣớc tiểu và tiến hành lại tƣơng tự.
2.2.9.2. Quy trình xử lý mẫu nước tiểu xác định amlodipin besylat
Lấy 2ml mẫu nƣớc tiểu, thêm 1ml NaOH 0,2M + 1ml ZnSO4 5% vào lắc đều và li tâm hoặc lọc qua giấy lọc 0,45µm. Sau đó, lấy 2ml dung dịch sau khi lọc cho vào bình định mức 50ml, thêm 20 ml dung dịch đệm pH = 5,0, định mức đến vạch, cho vào bình điện hóa và tiến hành đo bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân theo tiến trình nhƣ trên. Hàm lƣợng amlodipin besylat trong mẫu đƣợc xác định bằng cách thêm chuẩn amlodipin besylat vào mẫu nƣớc tiểu và tiến hành lại tƣơng tự.
2.2.10. Phƣơng pháp định lƣợng nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin
Để định lƣợng hàm lƣợng các thuốc trên, sử dụng phƣơng pháp thêm chuẩn. Sử dụng phần mềm Excel và origin 7.5 để vẽ đồ thị, thiết lập phƣơng trình đƣờng chuẩn theo phƣơng pháp hồi quy tuyến tính và tính hệ số tƣơng quan, xác định độ nhạy và giới hạn phát hiện của phƣơng pháp.
Giới hạn phát hiện đƣợc tính theo quy tắc 3σ, để thuận tiện cho việc tính nhanh giới hạn phát hiện, trong tất cả các trƣờng hợp, yb (tín hiệu hoặc nồng độ mẫu trắng) và Sb (độ lệch chuẩn của tín hiệu hoặc nồng độ mẫu trắng) đều đƣợc tính toán dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn.
2.2.11. Xử lý số liệu phân tích [10]
Việc nghiên cứu và phát triển một phƣơng pháp phân tích mới là nhiệm vụ của các nhà phân tích. Song, để áp dụng vào phân tích thực tế thì yêu cầu bắt buộc là phải đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp đó.
Các đại lƣợng thống kê dùng để đánh giá độ tin cậy của một phƣơng pháp phân tích bao gồm: độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ).
2.2.11.1. Độ lặp lại
Độ lặp lại là độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ xi với giá trị trung bình x đo đƣợc hoặc xác định đƣợc trong cùng các điều kiện thí nghiệm. Độ lặp lại đƣợc xác
34
định thông qua độ lệch chuẩn tƣơng đối. Nhƣ vậy, khi độ lệch chuẩn hoặc độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) nhỏ thì sai số của phép đo hay phƣơng pháp phân tích nhỏ.
2.2.11.2. Độ đúng
Độ đúng là độ gần sát giữa kết quả xác định đƣợc và giá trị thật của nó. Giá trị µ của một chất phân tích đƣợc chấp nhận là giá trị thông báo trong chứng chỉ đi kèm với vật liệu so sánh (CRM). Các mẫu chuẩn (CMR) đƣợc cung cấp bởi đơn vị chế tạo, thƣờng là một tổ chức quốc tế nổi tiếng nhƣ Community Bureau of Reference (CBR), National Institute of Standard and Technology (NIST)... Độ đúng của phƣơng pháp phân tích đƣợc đánh giá thông qua việc phân tích mẫu chuẩn. Phƣơng pháp phân tích có độ đúng tốt khi kết quả xác định đƣợc nằm trong khoảng tin cậy của giá trị thực µ ± ɛ (ɛ đƣợc thông báo kèm theo µ trong chứng chỉ của mẫu chuẩn) hoặc có thể so sánh kết quả xác định đƣợc với giá trị thực µ theo chuẩn student (t):
Trong trƣờng hợp không có mẫu chuẩn, có thể đánh giá độ đúng thông qua việc phân tích mẫu thêm chuẩn, rồi tính độ thu hồi Rev. Ngoài ra, độ đúng của phƣơng pháp phân tích có thể đƣợc đánh giá thông qua việc so sánh giữa phƣơng pháp nghiên cứu với phƣơng pháp phân tích chuẩn khác bằng phƣơng pháp thống kê kiểm tra cặp tức là so sánh kết quả đo đƣợc giữa hai phƣơng pháp.
Trong phần luận án, độ đúng đƣợc đánh giá thông qua việc phân tích mẫu thêm chuẩn, xác định độ thu hồi của chất phân tích thêm vào mẫu.
2.2.11.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
Theo IUPAC và ISO thì giới hạn phát hiện (LOD) đƣợc xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc. Nhƣ vậy, LOD phụ thuộc vào thành phần nền của mẫu phân tích và do đó phải đƣợc đánh giá cho mỗi loại nền mẫu khác nhau khi sử dụng phƣơng pháp phân tích và phải đƣợc công bố trong tài liệu về xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp. Nhƣ vậy, có thể có một số cách xác định LOD của phép phân tích nhƣ sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Qui tắc 3: LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu
35
trắng hay tín hiệu nền. Cần chú ý mẫu trắng trong trƣờng hợp này phải là mẫu có thành phần nền nhƣ mẫu thực nhƣng không chứa chất phân tích.
Tức là : yLOD = yB k.SB
Với yB là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (ít nhất 10 thí nghiệm độc lập). SB là độ lệch chuẩn khi đo lặp lại tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn. Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì k3 nB j Bj B B y n y 1 1 i B Bi B B y y n S2 ( )2 1 1
Nhƣ vậy, nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể phát hiện đƣợc theo phƣơng trình hồi qui dạng y = a + bx trong phƣơng pháp đƣờng chuẩn đƣợc tính theo công thức: b a S y x B B LOD 3
Mẫu trắng thƣờng đƣợc tạo ra khi không có chất phân tích. Tuy nhiên, trong nhiều trƣờng hợp khi không có chất phân tích thì không thể đo đƣợc tín hiệu đo nên có thể thay mẫu trắng bằng mẫu thêm chuẩn bằng cách thêm một lƣợng biết trƣớc chất phân tích ở nồng độ nhỏ nhất có thể ghi nhận đƣợc tín hiệu vào nền mẫu thực, sau đó đo tín hiệu phân tích và cũng tính độ lệch chuẩn tƣơng tự nhƣ trên.
- Xác định LOD khi không có mẫu trắng
Một cách khác đƣợc dùng để tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các phép phân tích mà tín hiệu nền rất thấp hoặc không phân tích mẫu trắng là sử dụng độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi qui thay vì sử dụng độ lệch chuẩn đƣờng nền, tức là xem SB = Sy và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yB = a. Khi đó tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD = a + 3. Sy. Sau đó dùng phƣơng trình hồi qui có thể tìm đƣợc LOD.
xLOD =
b
Sy
. 3
36
2.2.11.4. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền (blank or background)[10].
yQ= yB + K. SB
Thông thƣờng LOQ đƣợc tính với K=10 tức là CQ =10. SB /b
2.1.11.6. Giới hạn tuyến tính [10]
Trong phân tích định lƣợng khi tăng nồng độ chất phân tích đến giá trị nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ thuộc tuyến tính. Tại nồng độ lớn nhất của chất phân tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phƣơng trình tuyến tính bậc nhất thì gọi là giới hạn tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lƣợng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính.
2.3. THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị phân tích điện hóa Autolab A III (Hà Lan) kết nối với hệ VA Stand 663 (Metrohm,Thụy Sĩ).
- Các điện cực và bình điện phân: Điện cực làm việc , điện cực than gƣơng (đƣờng kính 1,0 ± 0,1 mm) hoặc điê ̣n cƣ̣c gio ̣t thủy ngân t reo (HMDE, kích thƣớc 4); điện cực so sánh, Ag/AgCl/KCl 3M (SAgE); điện cực phụ trợ, thanh glassy cacbon; bình điện phân của hãng Metrohm có dung tích 80 ml.
- Cân phân tích Scientech SA 210- Mỹ, độ chính xác ± 0,0001 g
- Máy đo pH 211 của hãng Hana - Ý, độ chính xác ở 200C là ± 0,01 pH - Máy cất nƣớc cất hai lần WSC/4D của hãng Haminton - Anh
- Máy đo tổng trở điện hóa IM6 (hãng Zahner - elektrik, Đức), hệ đo 3 điện cực gồm điện cực làm việc là điện cực than gƣơng, điện cực so sánh là Ag/AgCl/KCl 3M, điện cực phụ trợ là thanh glassy các bon.
Các dụng cụ thuỷ tinh nhƣ buret , pipet, bình định mức ,... và các chai thủy tinh, chai nhựa PET đựng hóa chất đều đƣợc rửa sạch trƣớc khi dùng bằng cách: ngâm qua đêm trong dung dịch HNO3 2M, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần. Tất
37
cả các dụng cụ thí nghiệm nhƣ buret, pipet, bình định mức... đều đƣợc hiệu chuẩn trƣớc khi sử dụng.
Giữa các phép đo , hê ̣ điê ̣n cƣ̣c và bình điện phân đƣợc tráng rửa cẩn thận bằng nƣớc cất hai lần . Khi không sử dụng , hê ̣ điê ̣n cƣ̣c và bình điện phân đƣợc ngâm trong nƣớc cất hai lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2. Hóa chất
- Nƣớc dùng để pha chế hóa chất và tráng rửa dụng cụ là nƣớc cất 2 lần, đƣợc bảo quản trong chai nhựa PET hoặc chai thủy tinh sạch.
- Tất cả các hóa chất sử dụng trong quá trình phân tích là tinh khiết phân tích (p.a). Nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin đảm bảo chất lƣợng, sạch đƣợc kiểm định tại viện kiểm định thuốc (48 Hai Bà Trƣng Hà Nội ). Chất chuẩn đƣợc pha chế có tính đến độ tinh khiết của thuốc.
- Dung dịch gốc nifedipin 10-2mol/l đƣợc pha trong metanol.
- Dung dịch gốc amlodipin besylat 10-2 mol/l đƣợc pha trong metanol. - Dung dịch gốc cephalexin 10-2mol/l đƣợc pha trong nƣớc cất hai lần. Các dung dịch gốc, khi pha xong để trong bình tối và bảo quản ở 40C.
- Các dung dịch chuẩn nồng độ 10-4M và 10-6M đƣợc pha loãng hàng ngày từ dung dịch gốc. Bảo quản dung dịch trong lọ màu tối và lạnh 40C.
- Dung dịch đệm Britton-Robinson (đệm vạn năng) pH từ 2,0 đến 11,0 đƣợc pha từ hỗn hợp axit CH3COOH, axit H3PO4 và H3BO3 nồng độ 0,04M (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,2M (dung dịch B).
- Đệm acetat pH = 4,0 đƣợc pha từ dung dịch axít CH3COOH 0,2M với dung dịch CH3COONa 0,2M.
- Pha đệm Citrat - HCl pH = 3,8: Trộn 26ml dung dịch muối natri citrat 0,1M với 24ml dung dịch HCl 1M ta đƣợc 50 ml dung dịch đệm citrat - HCl pH = 3,8.
- Đệm phốt phát
38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐIỆN HÓA CỦA NIFEDIPIN TRÊN HMDE
3.1.1. Khảo sát các đặc tính von-ampe vòng của nifedipin
Để hiểu rõ về cơ chế và các quá trình điện hóa của nifedipin xảy ra trên điện cực HMDE, phƣơng pháp von-ampe vòng đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu. Các đƣờng von-ampe vòng đƣợc trình bày trên hình 3.1.
(A) (B)
Hình 3.1. A) Đƣờng CV của nifedipin. 1- tacc= 0s ; 2- tacc = 30s, Eacc= 0V;
ĐKTN: Nồng độ nifedipin 2.10-7M, đệm BR pH =4,0; ν = 12,5mV/s,
Erange = 0V ÷ -1,0V, kích thước giọt HMDE là 4; thời gian sục N2 là 300s, tcb = 5s.
B) Đƣờng CV của nifedipin tại các giá trị pH = 2,0; pH = 4,0 và pH = 10,0.
Các ĐKTN khác tương tự như A
Qua đƣờng CV trong khoảng thế từ 0V đến -1,0V (hình 3.1A) cho thấy, trên đƣờng phân cực catot quan sát đƣợc píc khử xuất hiện tại thế Ep = -0,42V, còn trên đƣờng phân cực anot không quan sát đƣợc píc oxi hóa nào. Nhƣ vậy, quá trình khử của nifedipin trên điện cực giọt thủy ngân là bất thuận nghịch.
Khi ghi đƣờng CV tại các giá trị pH = 2,0; pH = 4,0 và pH = 10,0 (hình 3.1.B.) thì các đƣờng CV chỉ quan sát đƣợc một píc khử trên đƣờng phân cực catot, không quan sát đƣợc píc nào trên đƣờng phân cực anot. Quan sát sự xuất hiện píc thấy rằng, khi pH tăng thì thế đỉnh píc dịch chuyển về phía âm hơn điều đó chứng tỏ
39
có sự tham gia của proton vào phản ứng điện hóa của nifedipin trên điện cực [49]. Nhƣ vậy, trong môi trƣờng nƣớc nifedipin đã bị khử trên điện cực và quá trình khử là bất thuận nghịch. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả trong môi trƣờng nƣớc [33, 37,45, 79].
3.1.1.1. Tính chất hấp phụ của nifedipin
Qua đƣờng von-ampe vòng hình 3.1A cho thấy khi có quá trình tích lũy chất trên bề mặt điện cực (tacc = 30s) thì tín hiệu cƣờng độ dòng cao hơn so với đƣờng CV không có quá trình tích lũy (tacc= 0s) nên có thể nói rằng có quá trình hấp phụ chất trên bề mặt điện cực. Tiếp tục quét 5 chu trình liên tục từ 0V đến -1,2V (hình 3.2), với điều kiện có tiến hành tích lũy chất 30s tại thế 0V, kết quả cho thấy vòng thứ nhất tín hiệu cƣờng độ dòng cao, tức là có quá trình hấp phụ chất trên điện cực, sau đó hòa tan chất ra khỏi bề mặt điện cực, ghi tiếp các vòng thứ 2-5 thì cƣờng độ dòng rất thấp so với píc ghi ở đƣờng phân cực catot vòng 1. Điều đó chứng tỏ có quá trình hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân treo.
Hình 3.2: Đƣờng von-ampe đa vòng của nifedipin
ĐKTN: Nồng độ nifedipin 2.10-7M, đệm
BR pH = 4,0; tacc = 30s, Eacc = 0V,
ν =12,5mV/s, Erange = 0V ÷ -1,2V, thời (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gian suc N2 là 300s..
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng hấp phụ
Tốc độ quét thế là thông số ảnh hƣởng đến diễn biến các phản ứng xảy ra