Theo IUPAC và ISO thì giới hạn phát hiện (LOD) đƣợc xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc. Nhƣ vậy, LOD phụ thuộc vào thành phần nền của mẫu phân tích và do đó phải đƣợc đánh giá cho mỗi loại nền mẫu khác nhau khi sử dụng phƣơng pháp phân tích và phải đƣợc công bố trong tài liệu về xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp. Nhƣ vậy, có thể có một số cách xác định LOD của phép phân tích nhƣ sau:
- Qui tắc 3: LOD đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu
35
trắng hay tín hiệu nền. Cần chú ý mẫu trắng trong trƣờng hợp này phải là mẫu có thành phần nền nhƣ mẫu thực nhƣng không chứa chất phân tích.
Tức là : yLOD = yB k.SB
Với yB là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (ít nhất 10 thí nghiệm độc lập). SB là độ lệch chuẩn khi đo lặp lại tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lƣợng số học đƣợc chọn theo độ tin cậy mong muốn. Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì k3 nB j Bj B B y n y 1 1 i B Bi B B y y n S2 ( )2 1 1
Nhƣ vậy, nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể phát hiện đƣợc theo phƣơng trình hồi qui dạng y = a + bx trong phƣơng pháp đƣờng chuẩn đƣợc tính theo công thức: b a S y x B B LOD 3
Mẫu trắng thƣờng đƣợc tạo ra khi không có chất phân tích. Tuy nhiên, trong nhiều trƣờng hợp khi không có chất phân tích thì không thể đo đƣợc tín hiệu đo nên có thể thay mẫu trắng bằng mẫu thêm chuẩn bằng cách thêm một lƣợng biết trƣớc chất phân tích ở nồng độ nhỏ nhất có thể ghi nhận đƣợc tín hiệu vào nền mẫu thực, sau đó đo tín hiệu phân tích và cũng tính độ lệch chuẩn tƣơng tự nhƣ trên.
- Xác định LOD khi không có mẫu trắng
Một cách khác đƣợc dùng để tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các phép phân tích mà tín hiệu nền rất thấp hoặc không phân tích mẫu trắng là sử dụng độ lệch chuẩn của phƣơng trình hồi qui thay vì sử dụng độ lệch chuẩn đƣờng nền, tức là xem SB = Sy và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yB = a. Khi đó tín hiệu thu đƣợc ứng với nồng độ phát hiện YLOD = a + 3. Sy. Sau đó dùng phƣơng trình hồi qui có thể tìm đƣợc LOD.
xLOD =
b
Sy
. 3
36
2.2.11.4. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ đƣợc xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lƣợng đƣợc với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lƣợng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền (blank or background)[10].
yQ= yB + K. SB
Thông thƣờng LOQ đƣợc tính với K=10 tức là CQ =10. SB /b
2.1.11.6. Giới hạn tuyến tính [10]
Trong phân tích định lƣợng khi tăng nồng độ chất phân tích đến giá trị nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ thuộc tuyến tính. Tại nồng độ lớn nhất của chất phân tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phƣơng trình tuyến tính bậc nhất thì gọi là giới hạn tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lƣợng đến giới hạn tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính.
2.3. THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị phân tích điện hóa Autolab A III (Hà Lan) kết nối với hệ VA Stand 663 (Metrohm,Thụy Sĩ).
- Các điện cực và bình điện phân: Điện cực làm việc , điện cực than gƣơng (đƣờng kính 1,0 ± 0,1 mm) hoặc điê ̣n cƣ̣c gio ̣t thủy ngân t reo (HMDE, kích thƣớc 4); điện cực so sánh, Ag/AgCl/KCl 3M (SAgE); điện cực phụ trợ, thanh glassy cacbon; bình điện phân của hãng Metrohm có dung tích 80 ml.
- Cân phân tích Scientech SA 210- Mỹ, độ chính xác ± 0,0001 g
- Máy đo pH 211 của hãng Hana - Ý, độ chính xác ở 200C là ± 0,01 pH - Máy cất nƣớc cất hai lần WSC/4D của hãng Haminton - Anh
- Máy đo tổng trở điện hóa IM6 (hãng Zahner - elektrik, Đức), hệ đo 3 điện cực gồm điện cực làm việc là điện cực than gƣơng, điện cực so sánh là Ag/AgCl/KCl 3M, điện cực phụ trợ là thanh glassy các bon.
Các dụng cụ thuỷ tinh nhƣ buret , pipet, bình định mức ,... và các chai thủy tinh, chai nhựa PET đựng hóa chất đều đƣợc rửa sạch trƣớc khi dùng bằng cách: ngâm qua đêm trong dung dịch HNO3 2M, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần. Tất
37
cả các dụng cụ thí nghiệm nhƣ buret, pipet, bình định mức... đều đƣợc hiệu chuẩn trƣớc khi sử dụng.
Giữa các phép đo , hê ̣ điê ̣n cƣ̣c và bình điện phân đƣợc tráng rửa cẩn thận bằng nƣớc cất hai lần . Khi không sử dụng , hê ̣ điê ̣n cƣ̣c và bình điện phân đƣợc ngâm trong nƣớc cất hai lần.
2.3.2. Hóa chất
- Nƣớc dùng để pha chế hóa chất và tráng rửa dụng cụ là nƣớc cất 2 lần, đƣợc bảo quản trong chai nhựa PET hoặc chai thủy tinh sạch.
- Tất cả các hóa chất sử dụng trong quá trình phân tích là tinh khiết phân tích (p.a). Nifedipin, amlodipin besylat và cephalexin đảm bảo chất lƣợng, sạch đƣợc kiểm định tại viện kiểm định thuốc (48 Hai Bà Trƣng Hà Nội ). Chất chuẩn đƣợc pha chế có tính đến độ tinh khiết của thuốc.
- Dung dịch gốc nifedipin 10-2mol/l đƣợc pha trong metanol.
- Dung dịch gốc amlodipin besylat 10-2 mol/l đƣợc pha trong metanol. - Dung dịch gốc cephalexin 10-2mol/l đƣợc pha trong nƣớc cất hai lần. Các dung dịch gốc, khi pha xong để trong bình tối và bảo quản ở 40C.
- Các dung dịch chuẩn nồng độ 10-4M và 10-6M đƣợc pha loãng hàng ngày từ dung dịch gốc. Bảo quản dung dịch trong lọ màu tối và lạnh 40C.
- Dung dịch đệm Britton-Robinson (đệm vạn năng) pH từ 2,0 đến 11,0 đƣợc pha từ hỗn hợp axit CH3COOH, axit H3PO4 và H3BO3 nồng độ 0,04M (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,2M (dung dịch B).
- Đệm acetat pH = 4,0 đƣợc pha từ dung dịch axít CH3COOH 0,2M với dung dịch CH3COONa 0,2M.
- Pha đệm Citrat - HCl pH = 3,8: Trộn 26ml dung dịch muối natri citrat 0,1M với 24ml dung dịch HCl 1M ta đƣợc 50 ml dung dịch đệm citrat - HCl pH = 3,8.
- Đệm phốt phát
38
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐIỆN HÓA CỦA NIFEDIPIN TRÊN HMDE
3.1.1. Khảo sát các đặc tính von-ampe vòng của nifedipin
Để hiểu rõ về cơ chế và các quá trình điện hóa của nifedipin xảy ra trên điện cực HMDE, phƣơng pháp von-ampe vòng đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu. Các đƣờng von-ampe vòng đƣợc trình bày trên hình 3.1.
(A) (B)
Hình 3.1. A) Đƣờng CV của nifedipin. 1- tacc= 0s ; 2- tacc = 30s, Eacc= 0V;
ĐKTN: Nồng độ nifedipin 2.10-7M, đệm BR pH =4,0; ν = 12,5mV/s,
Erange = 0V ÷ -1,0V, kích thước giọt HMDE là 4; thời gian sục N2 là 300s, tcb = 5s.
B) Đƣờng CV của nifedipin tại các giá trị pH = 2,0; pH = 4,0 và pH = 10,0.
Các ĐKTN khác tương tự như A
Qua đƣờng CV trong khoảng thế từ 0V đến -1,0V (hình 3.1A) cho thấy, trên đƣờng phân cực catot quan sát đƣợc píc khử xuất hiện tại thế Ep = -0,42V, còn trên đƣờng phân cực anot không quan sát đƣợc píc oxi hóa nào. Nhƣ vậy, quá trình khử của nifedipin trên điện cực giọt thủy ngân là bất thuận nghịch.
Khi ghi đƣờng CV tại các giá trị pH = 2,0; pH = 4,0 và pH = 10,0 (hình 3.1.B.) thì các đƣờng CV chỉ quan sát đƣợc một píc khử trên đƣờng phân cực catot, không quan sát đƣợc píc nào trên đƣờng phân cực anot. Quan sát sự xuất hiện píc thấy rằng, khi pH tăng thì thế đỉnh píc dịch chuyển về phía âm hơn điều đó chứng tỏ
39
có sự tham gia của proton vào phản ứng điện hóa của nifedipin trên điện cực [49]. Nhƣ vậy, trong môi trƣờng nƣớc nifedipin đã bị khử trên điện cực và quá trình khử là bất thuận nghịch. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả trong môi trƣờng nƣớc [33, 37,45, 79].
3.1.1.1. Tính chất hấp phụ của nifedipin
Qua đƣờng von-ampe vòng hình 3.1A cho thấy khi có quá trình tích lũy chất trên bề mặt điện cực (tacc = 30s) thì tín hiệu cƣờng độ dòng cao hơn so với đƣờng CV không có quá trình tích lũy (tacc= 0s) nên có thể nói rằng có quá trình hấp phụ chất trên bề mặt điện cực. Tiếp tục quét 5 chu trình liên tục từ 0V đến -1,2V (hình 3.2), với điều kiện có tiến hành tích lũy chất 30s tại thế 0V, kết quả cho thấy vòng thứ nhất tín hiệu cƣờng độ dòng cao, tức là có quá trình hấp phụ chất trên điện cực, sau đó hòa tan chất ra khỏi bề mặt điện cực, ghi tiếp các vòng thứ 2-5 thì cƣờng độ dòng rất thấp so với píc ghi ở đƣờng phân cực catot vòng 1. Điều đó chứng tỏ có quá trình hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân treo.
Hình 3.2: Đƣờng von-ampe đa vòng của nifedipin
ĐKTN: Nồng độ nifedipin 2.10-7M, đệm
BR pH = 4,0; tacc = 30s, Eacc = 0V,
ν =12,5mV/s, Erange = 0V ÷ -1,2V, thời
gian suc N2 là 300s..
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng hấp phụ
Tốc độ quét thế là thông số ảnh hƣởng đến diễn biến các phản ứng xảy ra trên bề mặt điện cực nên việc khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ quét thế là cần thiết trong nghiên cứu phƣơng pháp von-ampe.
40
Hình 3.3: Đƣờng CV của nifedipin phụ thuộc vào tốc độ quét thế
ĐKTN: nồng độ nifedipin 2.10-7M, đệm BR pH =4,0; tacc =30s, Eacc = 0V, tcb =5s,
Erange = 0V ÷ -1,2V, thời gian sục khí N2 là 300s, ν =12,5mV/s ÷ 1000mV/s
Hình 3.4: Sự phụ thuộc logIp vào logν (ĐKTN như ở hình 3.3)
Kết quả đo đƣờng CV phụ thuộc vào tốc độ quét (ν) và đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc cƣờng độ dòng (logIp) vào logν đƣợc biểu diễn trên hình 3.4 cho thấy:
Khi tốc độ quét thế tăng thì thế đỉnh píc dịch chuyển về phía âm hơn (phụ lục bảng P5.1) và cƣờng độ dòng píc tăng tuyến tính với tốc độ quét từ 12,5mV/s đến 1000 mV/s theo phƣơng trình logIp = 0,065 + 0,87logν, hệ số tƣơng quan R = 0,999, hệ số góc của phƣơng trình giữa logIp và logv là 0,87, chứng tỏ nifedipin đã hấp phụ
41
mạnh trên điện cực giọt thủy ngân treo và lƣợng chất hấp phụ tăng theo tốc độ quét thế. Tuy nhiên, khi tăng tốc độ quét thế thì chân píc doãng ra. Thế đỉnh píc dịch chuyển sang phía âm hơn khi tăng tốc độ quét, điều này có thể khẳng định thêm rằng quá trình điện hóa xảy ra trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân là quá trình khử bất thuận nghịch và có sự tham gia của proton.
Nhƣ vậy, nifedipin có hấp phụ mạnh và khử trên điện cực giọt thủy ngân treo và quá trình khử đó là bất thuận nghịch. Có sự tham gia proton vào phản ứng điện hóa trên bề mặt điện cực HMDE.
3.1.2. Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hòa tan của nifedipin
Sau giai đoạn tích lũy chất trên bề mặt điện cực, chất đƣợc hòa tan và ghi tín hiệu hòa tan bằng một số kỹ thuật nhƣ dòng một chiều (DC), sóng vuông (SqW), xung vi phân (DP), xung thƣờng (NP). Các đƣờng hòa tan biểu diễn trên hình 3.5.
Hình 3.5. Đƣờng von-ampe hòa tan của nifedipin với các kỹ thuật ghi khác nhau 1) DC; 2) DPP; 3) SqW; 4) NP
ĐKTN: nifedipin 10-6M, tacc = 30s, Eacc= -0,2V, tcb = 5s, ν = 12,5mV/s,
Erange = -0,2V ÷ -1,0V
Qua khảo sát các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hòa tan cho thấy, trong cùng các điều kiện giống nhau thì giá trị cƣờng độ dòng của kỹ thuật xung thƣờng cao nhất, cao gấp 4 lần so với DP và khoảng 10 lần so với kỹ thuật DC. Tuy nhiên, mỗi kỹ thuật đều có những ƣu điểm riêng và nổi trội của phƣơng pháp, ví dụ nhƣ phƣơng pháp NP có độ nhạy cao, đặc biệt đối với những chất có khả năng hấp phụ mạnh trên bề mặt điện cực, có nhiều hứa hẹn với các hợp chất hữu cơ nhƣng độ chọn lọc
42
của phƣơng pháp kém hơn vì chân píc doãng ra. Đối với kỹ thuật SqW thì có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ độ nhạy và độ chọn lọc tốt, quét đƣợc tốc độ nhanh và thích hợp với các chất thuận nghịch. Kỹ thuật DP có lẽ là phƣơng pháp có độ nhạy và độ chọn lọc tốt nhất, do tín hiệu đƣợc ghi hai lần trƣớc và sau khi ngắt xung nên triệt tiêu đƣợc hầu nhƣ hoàn toàn dòng tụ điện nên đƣờng nền thấp và píc cân đối. Trong khuôn khổ của luận án, tác giả sử dụng hai kỹ thuật NP và kỹ thuật DP để khảo sát các đặc tính hấp phụ của nifedipin và áp dụng phƣơng pháp phân tích chúng. Trong đó, qua tham khảo tài liệu, tác giả chƣa thấy có công trình nào công bố sử dụng phƣơng pháp NP-AdSV để nghiên cứu tính chất điện hóa của nifedipin cũng nhƣ xác định chúng. Đây chính là một trong những điểm mới của luận án góp phần phát triển và mở rộng phƣơng pháp nghiên cứu.
3.1.3. Nghiên cứu các đặc tính hấp phụ của nifedipin bằng phƣơng pháp DP-AdSV
Theo kết quả nghiên cứu trong phƣơng pháp von-ampe vòng thì nifedipin có khả năng hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân treo và tham gia phản ứng khử cực trên đó. Vậy các yếu tố nào ảnh hƣởng đến quá trình hấp phụ đó và ảnh hƣởng nhƣ thế nào?. Trong phƣơng pháp von-ampe hòa tan xung vi phân, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố đến cƣờng độ dòng hấp phụ nhƣ thế tích lũy (thế hấp phụ), pH, thời gian tích lũy (thời gian hấp phụ), dung môi, nhiệt độ, tốc độ khuấy, nồng độ…
3.1.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thế tích lũy (Eacc)
Thế tích lũy là yếu tố quan trọng quyết định khả năng hấp phụ của chất trên bề mặt điện cực và tham gia phản ứng khử cực trên đó. Do vậy, thế tích lũy đƣợc khảo sát trƣớc tiên, sau đó sẽ khảo sát các yếu tố khác ảnh hƣởng đến thế tích lũy sao cho cƣờng độ dòng hấp phụ là lớn nhất.
43
Hình 3.6: Sự phụ thuộc Ip vào Eacc
ĐKTN ghi đường SV: Nồng độ nifedipin 10-6M, pH = 4,0, tacc = 30s, tcb= 5s,
Eacc = 0V ÷ - 0,25V, ν = 12,5mV/s, Erange = 0V ÷ -1,0V.
Qua kết quả khảo sát thế tích lũy đƣợc biểu diễn trên hình 3.6 cho thấy, khi thế tích lũy thay đổi từ 0V đến - 0,2V thì cƣờng độ dòng píc tăng, cƣờng độ dòng gần nhƣ ổn định trong khoảng thế từ - 0,15V đến - 0,2V. Khi Eacc = - 0,25V thì giá trị cƣờng độ dòng bắt đầu giảm dần do thế tích lũy gần sát với giá trị thế đỉnh píc khử. Chính vì vậy, chọn thế tích lũy Eacc = -0,2V để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.3.2. Khảo sát ảnh hưởng pH
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới tín hiệu cƣờng độ dòng và thế đỉnh píc. pH ảnh hƣởng nhiều đến quá trình phản ứng xảy ra trên bề mặt điện cực cũng nhƣ quá trình hấp phụ trên đó. Các đƣờng vôn-ampe hòa tan phụ thuộc vào pH đƣợc biểu diễn trên hình 3.7, kết quả đo đƣợc trình bày bảng phụ lục P5.2.
44 -200m -400m -600m -800m U (V) -80.0n -60.0n -40.0n -20.0n 0 I (A )
Hình 3.7: Đƣờng von-ampe hòa tan xung vi phân phụ thuộc vào pH
ĐKTN: Nifedipin 10-6M, tacc = 30s, Eacc = -0,2V, tcb = 5s, Erange = 0 ÷ -1,0V,
ΔE = 50mV, ν = 12,5mV/s, thay đổi pH từ 2,0 ÷ 11,0.
Hình 3.8. Sự phụ thuộc Ip vào pH (ĐKTN như hình 3.7)
45
Hình 3.9: Sự phụ thuộc Ep vào pH (ĐKTN như hình 3.7)
Qua kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH cho thấy: