Tác giả Li và Chen [64] đã xác định cephalexin trong môi trƣờng kiềm. Tác giả Yet Benner đã xác định cephalexin trong môi trƣờng axít H2SO4 0,125M, sóng cực phổ tại thế -1,25V (so với SCE), khoảng tuyến tính giữa cƣờng độ dòng và nồng độ cephalexin từ 1 - 70μg/ml. Tác giả Fogg [41] đã xác định cephalexin bằng phƣơng pháp đo cực phổ một trong số các sản phẩm thủy phân sau khi hydro hóa ở pH = 7,4 ở 1000C trong 1 giờ. Tác giả Xu và các cộng sự [123] đã nghiên cứu tính chất điện hóa của cephalexin trong điều kiện có mặt và không có mặt H2O2, tác giả cũng đã tối ƣu hóa các điều kiện xác định cephalexin trong mẫu thuốc và mẫu huyết thanh với kỹ thuật cực phổ quét thế tuyến tính. Cụ thể, cephalexin đã cho sóng khử trong môi trƣờng HCl 0,03M tại thế -1,24V. Với nồng độ cephalexin cao hơn 8,68µg/ml thì có thêm sóng khử khác quan sát đƣợc tại thế Ep = - 0,9V. Khi có mặt H2O2, sóng khử tại thế Ep = - 0,9V đƣợc xúc tác bởi H2O2 khử thành gốc tự do .OH tạo thành sóng xúc tác. Tuy nhiên, sóng khử tại thế E p = -1,24V giữ nguyên, hầu nhƣ không thay đổi. Việc định lƣợng cephalexin trong mẫu dựa vào sóng khử, khoảng nồng độ xác định là 1,0.10-7M - 2,5.10-5M, giới hạn phát hiện là 5,0.10-8M.
Tác giả Chailapakul [29] đã sử dụng điện cực màng mỏng kim cƣơng có thêm lƣợng nhỏ Bo để nghiên cứu tính chất điện hóa của glutathione và cephalexin trong môi trƣờng đệm cacbonat 0,1M pH = 9,2. Khoảng động học tuyến tính cho glutathione là 0,1-5,0 mM với giới hạn phát hiện là 10 μM. Đối với cephalexin thì giới hạn phát hiện là 5,0mM.
Một số tác giả khác đã xác định họ cephalosporin bằng phƣơng pháp cực phổ, phƣơng pháp von-ampe hòa tan [49, 58, 76, 78, 96].
16
1.4. GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÕA TAN HẤP PHỤ 1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV)
Quy trình phân tích theo phƣơng pháp AdSV cũng đƣợc thực hiện qua ba giai đoạn: giai đoạn làm giàu động, giai đoạn dừng và giai đoạn hòa tan tĩnh [8, 18, 21, 25, 67, 101, 117, 118, 119, 120].
Phƣơng pháp AdSV về cơ bản giống phƣơng pháp von-ampe hoà tan, chỉ có điểm khác cơ bản so với phƣơng pháp von-ampe hoà tan là cơ chế của quá trình làm giàu (hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt điện cực) bằng cách hấp phụ chất phân tích lên bề mặt điện cực làm việc tiếp xúc dung dịch. Sau làm giàu vẫn phân cực hoà tan nhƣ phƣơng pháp von-ampe hoà tan.
1.4.1.1. Giai đoạn làm giàu
Trƣớc hết, chất phân tích đƣợc tích luỹ bằng cách hấp phụ (điện hóa, vật lý, hóa học) lên ranh giới tiếp xúc dung dịch - điện cực làm việc. Trong thời gian làm giàu, thế trên điện cực làm việc đƣợc giữ không đổi, dung dịch đo đƣợc khuấy. Thông thƣờng AdSV có thể đƣợc thực hiện trên hầu hết các loại điện cực dùng trong von-ampe, ví dụ nhƣ: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV đều sử dụng điện cực HMDE do điện cực này có nhiều ƣu điểm: bề mặt đƣợc tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động hoá.
Cụ thể cơ chế của quá trình hấp phụ làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực có thể xảy ra theo các cơ chế sau:
1) Ion Mn+ tạo phức với phối tử L, phản ứng này xảy ra trong dung dịch (dd) và đây là quá trình hóa học:
Mn+ + xL MLxn+ (dd)
Phối tử L có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là vô cơ có sẵn hoặc đƣợc thêm vào dung dịch phân tích.
Phức chất tạo thành ngay lập tức hấp phụ (hp) lên bề mặt điện cực làm việc: MLxn+ (dd) MLxn+ (hp)
17
2) Phối tử ta ̣o phƣ́c L (thƣờng là các hợp chất hữu cơ) bị hấp phụ hoă ̣c đƣợc đƣa lên bề mặt điện cực làm việc trƣớc khi tạo phức chất:
xL (dd) xL (hp)
Sau đó, phối tử L trên bề mặt điện cực làm việc phản ứng tạo phức với Mn+ ở lớp sát bề mă ̣t điện cực và đây là quá trình hóa học:
Mn+ (dd) + xL (hp) MLxn+ (hp)
Nếu tốc độ của hai quá trình hấp phụ và hóa học tƣơng đƣơng nhau thì sự hấp phụ và tạo phức xảy ra đồng thời, và do vậy rất khó phân biệt.
3) Ion kim loại Mn+ không tạo phức với phối tử L, mà sản phẩm của quá trình oxi hóa hoặc khử điện hóa của nó mới tạo phức với phối tử L. Trƣờng hợp này, thƣờng xảy ra với các kim loại đa hóa trị nhƣ: Co, Cr, V, Ti, Mo, U, As, Fe…
Mn+ (dd) me– Mn±m (dd) Mn±m (dd) + xL (dd) MLxn±m (dd)
MLxn±m (dd) MLxn±m (hp)
4) Quá trình làm giàu Mn+ trên bề mặt điện cực làm việc xảy ra theo cơ chế tổng hợp, bao gồm cả hai cơ chế 2) và 3) đƣơ ̣c mô tả ở trên, tức là:
xL (dd) xL (hp)
Mn+ (dd) me– Mn±m (dd) Mn±m (dd) + xL (hp) MLxn±m (hp)
Tuy nhiên, trong quá trình hấp phụ có thể chỉ theo một trong các cơ chế trên hoặc có thể là đồng thời cùng xảy ra. Nghiên cứu sinh không tập trung đi sâu theo hƣớng nghiên cứu cơ chế mà chỉ nghiên cứu các yếu tố đặc trƣng ảnh hƣởng đến quá trình hấp phụ đó vì trong luận án này không đo từng dòng hấp phụ mà đo dòng hòa tan của sản phẩm quá trình hấp phụ . Nhìn chung có ba kiểu hấp phụ đặc trƣng đó là hấp phụ theo kiểu điện hóa, hấp phụ do ái lực hóa học (nhóm chức có khả năng hấp phụ) và hấp phụ đẳng nhiệt. Đối với một số chất hữu cơ, bản thân của các
18
chất đó có những nhóm chức có khả năng hấp phụ lên bề mặt điện cực tại những thế xác định gọi là thế tích lũy (tacc) và đây là một trong những đối tƣợng nghiên cứu mới của phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ đƣợc áp dụng để phân tích các chất hữu cơ có hoạt tính sinh học trong dƣợc phẩm.
1.4.1.2. Giai đoạn dừng
Sau giai đoạn làm giàu là giai đoạn dừng để chất phân bố đều trên bề mặt điện cực làm việc và chuyển dung dịch tƣ̀ tra ̣ng thái đô ̣ng sang tra ̣ng thái tĩnh cho kết quả ghi dòng ổn đi ̣nh hơn.
1.4.1.3. Giai đoạn hòa tan tĩnh
Giai đoạn hòa tan tĩnh là ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật von-ampe nào đó, chẳng hạn: von- ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), khi đó phƣơng pháp đƣợc gọi là von- ampe hòa tan catot hấp phụ xung vi phân (DP-AdSV) [93, 100] hoặc von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW) khi đó phƣơng pháp đƣợc gọi là von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông (SW-AdSV) [44, 45, 59 79]. Ngƣợc lại, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều anot, tức là quét thế dƣơng dần để oxy hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng các kỹ thuật von-ampe. Khi đó phƣơng pháp sẽ có tên go ̣i von-ampe hòa tan anot.
Đối với phƣơng pháp AdSV, tín hiệu hòa tan thu đƣợc có dạng đỉnh, là cơ sở để định lƣợng chất phân tích. Theo Pihlar, Valenta và Nurnbergh [87] tín hiệu von- ampe hòa tan tỉ lệ thuận với nồng độ bề mặt của chất đƣợc hấp phụ trên cực làm việc theo phƣơng trình:
Q = n.F.S.C0
Trong đó, Q (C) là điện lƣợng cần thiết để khử chất điện hoạt đã đƣợc hấp phụ, n là số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng, F (C/mol) là hằng số Faraday, S (cm2) là diện tích bề mặt điện cực và C0 (mol/cm2) là nồng độ bề mặt của chất đƣợc hấp phụ trên điện cực.
19
Với một tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh píc hòa tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q nên Ip tỉ lệ với S và C0. Mà C0 tỉ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C) khi các điều kiê ̣n hấp phu ̣ đƣợc lă ̣p la ̣i, nên Ip tỉ lệ với S và C tức là: Ip S.C. Để đạt đƣợc độ nhạy cao khi phân tích bằng AdSV cần tìm các điều kiện tối ƣu cho quá trình hấp phụ. Do vậy, cƣờng độ dòng phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ loại điện cực, thời gian tích lũy, thế tích lũy, dung môi, đặc tính bề mặt của điện cực, diện tích điện cực, lực ion, pH và nhiệt độ. Vì thế, cƣờng độ dòng Ip = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm, phụ thuộc vào các điều kiện: 1) điều kiện tích lũy (làm giàu) nhƣ thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, nhiệt độ và thành phần dung dịch nhƣ pH, nồng độ đệm; 2) Điều kiện hòa tan nhƣ tốc độ quét thế, kiểu quét thế (xung vi phân, xung thƣờng, sóng vuông, dòng xoay chiều); 3) Nồng độ chất nghiên cứu và bản chất của chất trong dung dịch (chất đó có khả năng hấp phụ trực tiếp hay gián tiếp thông qua tạo phức với các phối tử khác). Khi khống chế đƣợc các điều kiện tích lũy và thành phần dung dịch thì tìm đƣợc mối quan hệ trực tiếp Ip và C. Ip bị ảnh hƣởng trực tiếp bởi bản chất của chất hấp phụ và bị ảnh hƣởng gián tiếp vào thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, thành phần dung dịch điện phân, nhiệt độ... do vậy phải nghiên cứu chọn các điều kiện tối ƣu để hệ số K không thay đổi, đảm bảo độ lặp lại và độ chính xác của phép đo. Cần phải nhấn mạnh thêm rằng, thực chất của phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ là thực hiện quá trình tích lũy chất lên bề mặt điện cực (giai đoạn tích lũy chất tại một thế cố định trong một thời gian nhất định nhƣ là một kỹ thuật làm giàu chất), sau đó ghi tín hiệu hòa tan, tín hiệu thu đƣợc dạng píc là dòng hoà tan của sản phẩm hấp phụ lên bề mặt điện cực.
Thế đỉnh píc hòa tan (Ep) và cƣờng độ dòng píc hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ : thành phần nền , phối tử ta ̣o phƣ́c , pH, thời gian tích lũy , thế tích lũy, bản chất của điện cực làm việc , kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan. Trong những điều kiện xác định, Ep đặc trƣng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và do đó dùng để phân tích định tính. Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch, do vậy Ip dùng để phân tích định lƣợng.
20
Phƣơng pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích các ion kim loại không thể xác định đƣợc bằng kĩ thuật cực phổ thông thƣờng (hay quá trình xác định rất phức tạp) nhƣ Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay các chất hữu cơ. Cũng nhƣ von-ampe hoà tan thông thƣờng, phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ nhạy hơn so với các phƣơng pháp von-ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ). Ngoài những ƣu điểm trên, phƣơng pháp AdSV còn có những ƣu điểm riêng so với phƣơng pháp SV nhƣ:
- Độ nhạy của AdSV thƣờng lớn hơn nhiều so với ASV do kim loại không hoà tan trong thuỷ ngân mà tạo thành các lớp phức đơn phân tử, ví dụ nhƣ điện cực màng thuỷ ngân.
- Xác định đƣợc nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phƣơng pháp ASV và CSV do có thể lựa chọn đƣợc nhiều thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc với kim loại cần phân tích [21, 28].
- AdSV đặc biệt tỏ ra có ƣu điểm trong phân tích các chất có hoạt tính sinh học, dƣợc phẩm bao gồm những chất có hoạt tính điện hóa, có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt Hg và cả các chất không có hoạt tính điện hóa trực tiếp trên điện cực giọt cũng có thể đƣợc xác định sau khi dẫn xuất hoá bằng cách gắn với các nhóm dễ khử nhƣ nitroso, nitro..hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính điện hóa [30, 33, 38, 41, 84, 107, 119, 110]. Ƣu điểm đó sẽ đƣợc chứng minh trong phần kết quả của luận án.
- Một điểm đặc biệt của phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ là dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết đƣợc bài toán liên quan đến các quá trình điện cực, cơ chế phản ứng xảy ra trên điện cực nhƣ thế nào [37, 124, 125].
- Phƣơng pháp AdSV có thể loại trừ đƣợc ảnh hƣởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp nhƣ: thành phần nền, pH, và thế hấp phu ̣ làm giàu [8].
1.4.2. Các kỹ thuật ghi đƣờng von-ampe hòa tan hấp phụ [8, 28, 31, 50, 103]
Trong phƣơng pháp AdSV, các kỹ thuật sử dụng để ghi đƣờng von-ampe hòa tan là von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), von-ampe xung thƣờng (Normal Pulse - NP) và von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW), khi đó tên của
21
phƣơng pháp đƣợc gắn thêm tên của kỹ thuật đo, chẳng hạn nhƣ: Von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân DP-AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ xung thƣờng NP - AdSV; Von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông SW-AdSV. Phƣơng pháp NP -AdSV tỏ ra có nhiều ƣu điểm đối với một số chất hữu cơ, theo lý thuyết thì tín hiệu cƣờng độ dòng thu đƣợc trong phƣơng pháp NP - AdSV cao gấp khoảng 4 lần so với phƣơng pháp DP - AdSV. Von-ampe hòa tan sóng vuông thích hợp với các chất phân tích có đặc tính thuận nghịch. Nhìn chung, các chất hữu cơ có đặc tính điện hóa là bất thuận nghịch vì thế phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân thƣờng hay đƣợc áp dụng để nghiên cứu và định lƣợng cho các đối tƣợng nghiên cứu.
1.4.2.1. Kỹ thuật xung vi phân (DP)
Trong kỹ thuật xung vi phân, điện cực đƣợc phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với một tốc độ chậm nhƣng vào cuối mỗi chu kì xung trên khung điện áp biến đổi một chiều ngƣời ta đặt thêm một xung vuông góc với biên độ thay đổi từ 10 - 100mV và độ dài xung từ 40 - 100ms. Cƣờng độ dòng đƣợc ghi hai lần, lần 1 tại thời điểm i1, thƣờng là 17ms trƣớc khi nạp xung và lần hai là 17ms trƣớc khi cắt xung, lúc này ghi dòng cực phổ dƣới tác dụng của xung. Hai giá trị này đƣợc gửi vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó. Tín hiệu có dạng một cực đại.
1.4.2.2. Kỹ thuật xung thường (NP)
Trong kỹ thuật xung thƣờng, điện cực đƣợc phân cực bằng một điện áp 1 chiều chọn trƣớc và giữ không đổi trong suốt quá trình , gọi là thế khởi điểm hay thế nền tƣơng ứng với chân píc thu đƣợc. Tại một thời điểm xác định, điê ̣n cƣ̣c đƣợc phân cƣ̣c thêm mô ̣t xung da ̣ng vuông góc có thời gian tồn ta ̣i ngắn (40-100 ms), sau đó xung bi ̣ ngắt và thế điện cực trở về điện áp khởi điểm. Biên đô ̣ xung tăng dần theo thời gian với tốc độ đều. Cƣờng độ dòng đƣợc ghi tại một thời điểm, thƣờng 17ms trƣớc khi ngắt xung t(i).
1.4.2.3. Kỹ thuật sóng vuông
Theo kỹ thuật này, điện cực đƣợc phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên đều, đƣợc đặt chồng lên điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số từ 8 Hz
22
đến 2000 Hz, biên độ từ 1 đến 50 mV. Trong mỗi chu kỳ xung, dòng đƣợc đo hai lần: thời điểm 1 (dòng dƣơng I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2). Dòng thu đƣợc là hiệu của hai giá trị dòng đó (Ip = I1 - I2) và Ip là hàm của thế áp vào điện cực làm việc và nồng đô ̣ chất khảo sát [68]. Đối với các chất có tính thuận nghịch thì kỹ thuật hòa tan sóng vuông có độ nhạy cao hơn kỹ thuật xung vi phân.
1.4.3. Các yếu tố cần khảo sát khi xây dựng một quy trình phân tích theo phƣơng pháp AdSV phƣơng pháp AdSV
Khi nghiên cứu tính chất điện hóa của một chất bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan thì phƣơng pháp von-ampe vòng rất hiệu quả trong việc nghiên cứu khả năng hấp phụ và các đặc tính điện hóa của một chất. Dựa trên đƣờng von-ampe vòng có thể cho phép lý giải đƣợc các quá trình điện hóa xảy ra, đó là quá trình oxy hóa hay quá trình khử, các píc thuận nghịch hay bất thuận nghịch, thế đỉnh píc xuất hiện trong khoảng thế nào. Từ đó lựa chọn đƣợc các loại điện cực có thể sử dụng để xác định chất đó.