1.3.1.1. Phương pháp chuẩn độ
Cân chính xác 0,4 g chế phẩm nifedipin, hòa tan trong 50ml etanol, thêm 50 ml dung dịch axít perchloric (pha loãng 8,5ml axít perchloric 70% với nƣớc thành 100ml), cho 3 giọt chỉ thị o-phenanthrolin, chuẩn độ bằng dung dịch ceri sunfat 0,1M cho đến khi màu hồng biến mất, song song tiến hành với mẫu trắng. 1ml dung dịch ceri sunfat 0,1M tƣơng đƣơng với 17,32 mg C17H18N2O6 [86].
1.3.1.2. Phương pháp HPLC
Tiến hành xác định nifedipin bằng phƣơng pháp HPLC với thành phần pha động: acetonitril - metanol - nƣớc và điều kiện sắc ký là: cột C18 (5µm), detector UV đặt ở bƣớc sóng 235nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 20µl [1, 16, 17, 115]. Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp sắc ký rộng từ 10 - 200ng/ml, giới hạn xác định là 3ng/ml huyết thanh. Nếu sử dụng detector điện hóa thì khoảng xác định của nifedipin 2,5 - 50,0 ng/ml và LOQ là 1,0ng/ml mẫu huyết thanh [56, 57, 60, 71, 72, 95].
Tác giả Patravale [83] và cộng sự đã xác định nifedipin trong mẫu thuốc thƣơng phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC). Dung môi chiết là metanol và thành phần pha động là chloroform : ethyl acetat : cyclohexan (19 : 2 : 2, v/v/v). Khoảng tuyến tính của nifedipin từ 180 - 720ng, LOD là 20ng và LOQ là 40ng.
12
1.3.1.3. Phương pháp trắc quang
Một phƣơng pháp phân tích đơn giản, nhạy và kinh tế khi xác định nifedipin trong các mẫu thuốc dạng bào chế hay dạng viên nang đó là phƣơng pháp trắc quang. Tùy thuộc vào điều kiện thực nghiệm, nifedipin sẽ phản ứng với thuốc thử đó và có màu, cƣờng độ màu sẽ tỉ lệ với hàm lƣợng chất cần xác định. Nhóm tác giả Rahman [89, 90] đã nghiên cứu và xác định nifedipin trong mẫu thuốc dựa vào phản ứng tạo màu giữa nhóm nitro của nifedipin với KOH trong nền dimethyl sulphoxide (DMSO) và đo độ hấp thụ quang tại bƣớc sóng 430nm, khoảng xác định 5,0 - 50,0 µg/ml. Ngoài nền DMSO thì nifedipin có thể xác định với KOH trong aceton, alcohol, N,N’ - dimethylforamide tạo thành ion nitroquinoid. Đồng thời tác giả đã xác định nifedipin bằng thuốc thử ammonium molybdat (MoVI) trong môi trƣờng đệm photphat/citric ở nhiệt độ 1000C, màu xanh tạo thành đƣợc đo tại bƣớc sóng 830nm.
1.3.1.4. Phương pháp von-ampe hòa tan
Nifedipin đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan trong một số nền khác nhau nhƣ KCl, đệm Britton Robinson pH = 11,0 sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE), khoảng tuyến tính 10,0µg/l - 100,0µg/l. Phƣơng pháp đã áp dụng để xác định hàm lƣợng nifedipin bơm vào trong mẫu huyết thanh với hiệu suất thu hồi là 96,20% đến 99,47% [33, 45, 79, 100].
Ngoài HMDE, nifedipin còn đƣợc xác định bằng điện cực GCE hoạt hóa, CPE biến tính với LOD là 3,46mg/l và 1,35mg/l tƣơng ứng [93, 97].
1.3.2. Các phƣơng pháp xác định amlodipin besylat
1.3.2.1. Phương pháp trắc quang
Một số tác giả đã xác định amlodipin besylat bằng phƣơng pháp trắc quang dựa vào phản ứng tạo phức hoặc oxy hóa khử trong các môi trƣờng khác nhau [15, 26, 32, 46, 53, 69, 92, 99, 105]. Cụ thể, nhóm tác giả, Shama, Amin, Mabrouk và Omara [99] đã xác định amlodipin besylat dựa vào sự oxi hóa của thuốc với KMnO4 trong môi trƣờng axít, lƣợng KMnO4 dƣ đƣợc xác định bằng cách đo độ giảm độ hấp thụ quang của các thuốc thử cho vào nhƣ methylen xanh (MB), axít xanh 74 (AB), axít đỏ 73 (AR), thuốc nhuộm amaranth (AM) và axít da cam 7 (AO) tại các bƣớc sóng
13
cực đại λmax 663nm, 609nm, 511nm, 520nm và 484nm, tƣơng ứng. Giới hạn phát hiện tƣơng ứng với các thuốc thử là 0,277 µg/ml; 0,249 µg/ml; 0,329 µg/ml ; 0,239 µg/ml; 0,272 µg/ml.
Nhóm tác giả Basavaiah [26] đã xác định hàm lƣợng amlodipin besylat bằng hỗn hợp BrO3- - Br- với thuốc thử metyl da cam trong môi trƣờng axít, lƣợng brom sinh ra sẽ phản ứng với amlodipin besylat, lƣợng brom (Br2) dƣ đƣợc xác định dựa vào phản ứng làm mất màu metyl da cam, đo độ giảm màu tại bƣớc sóng 520nm, khoảng nồng độ amlodipin besylat có thể xác định đƣợc từ 0,5 - 3,0 µg/ml.
Tác giả Golcu, Yucesoy [46] đã xác định amlodipin besylat dựa vào phản ứng tạo phức giữa amlodipin với thuốc thử bromophenol xanh tại pH = 3,2. Phức tạo thành đƣợc chiết vào chloroform và đo màu tại bƣớc sóng 414nm. Khoảng xác định amlodipin besylat tuân theo định luật Beer từ 6 - 30 μg/ml với phƣơng trình hồi quy tuyến tính A = 0,055C - 0,018 (R = 0,9997). Hiệu suất thu hồi 100,7% so với giá trị thuốc ghi trên nhãn và độ lệch chuẩn tƣơng đối là 1,24%.
Nhóm tác giả Rahman và Azmi [91] đã dựa vào phản ứng giữa nhóm amino của amlodipin besylat với ninhydrin trong nền N,N′-dimethylformamide (DMF) tạo thành phức có màu, đo cƣờng độ màu tại bƣớc sóng 595nm. Khoảng xác định tuân theo định luật Beer từ 10 - 60 μg/ml với độ lệch chuẩn tƣơng đối 0,66%.
1.3.2.2. Phƣơng pháp HPLC
Theo tài liệu của dƣợc điển Việt Nam [1], các điều kiện để định lƣợng amlodipin besylat: Thành phần pha động là hỗn hợp 15ml dung dịch acetonitril, 35ml metanol và 50ml dung dịch chứa 7ml trietylamin trong 100ml đã đƣợc chỉnh pH = 3,0 bằng axít photphoric. Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh đƣợc nhồi C-18 (5µm), detector quang phổ tử ngoại đặt ở bƣớc sóng 237nm, tốc độ dòng 1,0ml/phút, thể tích tiêm 10µl.
Ƣu điểm nổi trội của phƣơng pháp sắc ký là có thể xác định đƣợc đồng thời nhiều chất trong cùng một mẫu rất hiệu quả bằng cách thay đổi thành phần pha động và các điều kiện sắc ký [4, 26, 27, 40, 42, 66, 72, 88].
14
1.3.2.3. Phƣơng pháp von-ampe hòa tan
Phƣơng pháp von-ampe hòa tan xác định amlodipin besylat dựa vào sự oxi hóa của nhóm dihydropyridin trên bề mặt điện cực rắn nhƣ điện cực GCE, CPE, điện cực than biến tính nano cacbon đơn hoặc đa vách [44, 48, 59]. Tác giả Gazy [44] đã sử dụng điện cực than gƣơng hoặc than mềm để xác định hàm lƣợng amlodipin besylat trong nền đệm Britton- Robinson pH = 11,0 khoảng nồng độ tuyến tính 22,24µg/l - 1132,10µg/l, LOD là 7,92µg/l, LOD khi xác định hàm lƣợng amlodipin besylat đƣợc bơm vào trong mẫu nƣớc tiểu là 1,3µg/ml. Khi sử dụng điện cực than mềm trong môi trƣờng đệm phốt phát pH = 11,0 chất điện li KCl 0,1M, khoảng nồng độ tuyến tính 5,51µg/l - 77,8 µg/l, LOD là 0,11µg/l [59].
1.3.3. Các phƣơng pháp xác định cephalexin
1.3.3.1. Phương pháp HPLC
Theo dƣợc điển Việt Nam, hàm lƣợng cephalexin đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC với thành phần pha động: metanol - acetonitril - dung dịch kalidyhidrophotphat 0,136% - nƣớc (2 : 5 :10 : 83), pha tĩnh đƣợc nhồi C-18 (5µm), detector tử ngoại đặt tại bƣớc sóng 254nm, thể tích tiêm 20 µl, tốc độ dòng 1,5ml/phút [1].
Theo tài liệu [63] thành phần pha động là acetonitril - metanol- đệm acetat pH = 4,2 (10 : 10 : 80%), giới hạn phát hiện cephalexin là 1 μg/ml trong mẫu huyết tƣơng và 5 μg/ml trong mẫu nƣớc tiểu.
Phƣơng pháp HPLC cho phép xác định đƣợc đồng thời họ cephalosporins với cột tách C-18, thành phần pha động là metanol - tetrahydrofuran - nƣớc theo tỉ lệ 16 :4 :80, giới hạn phát hiện là 0,5 μg/ml [73, 114].
Ngoài ra, họ β- lactam đƣợc xác định bằng phƣơng pháp điện di mao quản điện động học mixen (MEKC) [11].
1.3.3.2. Phương pháp trắc quang
Phƣơng pháp trắc quang dựa vào phản ứng giữa nhóm acetyl của cephalexin với anhydrit acetic trong dung dịch nƣớc tại pH = 11,5 để tạo thành α-acetamidocephalexin và sau đó đo tại bƣớc sóng 335nm của α-acetamidocephalexin mercuric mercaptide,
15
khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer là 30-340 μg/ml [18]. Một số thuốc thử khác đƣợc sử dụng để định lƣợng cephalexin có trong thuốc đã đƣợc công bố [24, 43, 61, 82, 114].
1.3.3.3. Phƣơng pháp cực phổ
Tác giả Li và Chen [64] đã xác định cephalexin trong môi trƣờng kiềm. Tác giả Yet Benner đã xác định cephalexin trong môi trƣờng axít H2SO4 0,125M, sóng cực phổ tại thế -1,25V (so với SCE), khoảng tuyến tính giữa cƣờng độ dòng và nồng độ cephalexin từ 1 - 70μg/ml. Tác giả Fogg [41] đã xác định cephalexin bằng phƣơng pháp đo cực phổ một trong số các sản phẩm thủy phân sau khi hydro hóa ở pH = 7,4 ở 1000C trong 1 giờ. Tác giả Xu và các cộng sự [123] đã nghiên cứu tính chất điện hóa của cephalexin trong điều kiện có mặt và không có mặt H2O2, tác giả cũng đã tối ƣu hóa các điều kiện xác định cephalexin trong mẫu thuốc và mẫu huyết thanh với kỹ thuật cực phổ quét thế tuyến tính. Cụ thể, cephalexin đã cho sóng khử trong môi trƣờng HCl 0,03M tại thế -1,24V. Với nồng độ cephalexin cao hơn 8,68µg/ml thì có thêm sóng khử khác quan sát đƣợc tại thế Ep = - 0,9V. Khi có mặt H2O2, sóng khử tại thế Ep = - 0,9V đƣợc xúc tác bởi H2O2 khử thành gốc tự do .OH tạo thành sóng xúc tác. Tuy nhiên, sóng khử tại thế E p = -1,24V giữ nguyên, hầu nhƣ không thay đổi. Việc định lƣợng cephalexin trong mẫu dựa vào sóng khử, khoảng nồng độ xác định là 1,0.10-7M - 2,5.10-5M, giới hạn phát hiện là 5,0.10-8M.
Tác giả Chailapakul [29] đã sử dụng điện cực màng mỏng kim cƣơng có thêm lƣợng nhỏ Bo để nghiên cứu tính chất điện hóa của glutathione và cephalexin trong môi trƣờng đệm cacbonat 0,1M pH = 9,2. Khoảng động học tuyến tính cho glutathione là 0,1-5,0 mM với giới hạn phát hiện là 10 μM. Đối với cephalexin thì giới hạn phát hiện là 5,0mM.
Một số tác giả khác đã xác định họ cephalosporin bằng phƣơng pháp cực phổ, phƣơng pháp von-ampe hòa tan [49, 58, 76, 78, 96].
16
1.4. GIỚI THIỆU PHƢƠNG PHÁP VON-AMPE HÕA TAN HẤP PHỤ 1.4.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp von-ampe hoà tan hấp phụ (AdSV)
Quy trình phân tích theo phƣơng pháp AdSV cũng đƣợc thực hiện qua ba giai đoạn: giai đoạn làm giàu động, giai đoạn dừng và giai đoạn hòa tan tĩnh [8, 18, 21, 25, 67, 101, 117, 118, 119, 120].
Phƣơng pháp AdSV về cơ bản giống phƣơng pháp von-ampe hoà tan, chỉ có điểm khác cơ bản so với phƣơng pháp von-ampe hoà tan là cơ chế của quá trình làm giàu (hay quá trình tích luỹ chất trên bề mặt điện cực) bằng cách hấp phụ chất phân tích lên bề mặt điện cực làm việc tiếp xúc dung dịch. Sau làm giàu vẫn phân cực hoà tan nhƣ phƣơng pháp von-ampe hoà tan.
1.4.1.1. Giai đoạn làm giàu
Trƣớc hết, chất phân tích đƣợc tích luỹ bằng cách hấp phụ (điện hóa, vật lý, hóa học) lên ranh giới tiếp xúc dung dịch - điện cực làm việc. Trong thời gian làm giàu, thế trên điện cực làm việc đƣợc giữ không đổi, dung dịch đo đƣợc khuấy. Thông thƣờng AdSV có thể đƣợc thực hiện trên hầu hết các loại điện cực dùng trong von-ampe, ví dụ nhƣ: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV đều sử dụng điện cực HMDE do điện cực này có nhiều ƣu điểm: bề mặt đƣợc tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động hoá.
Cụ thể cơ chế của quá trình hấp phụ làm giàu chất phân tích lên bề mặt điện cực có thể xảy ra theo các cơ chế sau:
1) Ion Mn+ tạo phức với phối tử L, phản ứng này xảy ra trong dung dịch (dd) và đây là quá trình hóa học:
Mn+ + xL MLxn+ (dd)
Phối tử L có thể là hợp chất hữu cơ hoặc là vô cơ có sẵn hoặc đƣợc thêm vào dung dịch phân tích.
Phức chất tạo thành ngay lập tức hấp phụ (hp) lên bề mặt điện cực làm việc: MLxn+ (dd) MLxn+ (hp)
17
2) Phối tử ta ̣o phƣ́c L (thƣờng là các hợp chất hữu cơ) bị hấp phụ hoă ̣c đƣợc đƣa lên bề mặt điện cực làm việc trƣớc khi tạo phức chất:
xL (dd) xL (hp)
Sau đó, phối tử L trên bề mặt điện cực làm việc phản ứng tạo phức với Mn+ ở lớp sát bề mă ̣t điện cực và đây là quá trình hóa học:
Mn+ (dd) + xL (hp) MLxn+ (hp)
Nếu tốc độ của hai quá trình hấp phụ và hóa học tƣơng đƣơng nhau thì sự hấp phụ và tạo phức xảy ra đồng thời, và do vậy rất khó phân biệt.
3) Ion kim loại Mn+ không tạo phức với phối tử L, mà sản phẩm của quá trình oxi hóa hoặc khử điện hóa của nó mới tạo phức với phối tử L. Trƣờng hợp này, thƣờng xảy ra với các kim loại đa hóa trị nhƣ: Co, Cr, V, Ti, Mo, U, As, Fe…
Mn+ (dd) me– Mn±m (dd) Mn±m (dd) + xL (dd) MLxn±m (dd)
MLxn±m (dd) MLxn±m (hp)
4) Quá trình làm giàu Mn+ trên bề mặt điện cực làm việc xảy ra theo cơ chế tổng hợp, bao gồm cả hai cơ chế 2) và 3) đƣơ ̣c mô tả ở trên, tức là:
xL (dd) xL (hp)
Mn+ (dd) me– Mn±m (dd) Mn±m (dd) + xL (hp) MLxn±m (hp)
Tuy nhiên, trong quá trình hấp phụ có thể chỉ theo một trong các cơ chế trên hoặc có thể là đồng thời cùng xảy ra. Nghiên cứu sinh không tập trung đi sâu theo hƣớng nghiên cứu cơ chế mà chỉ nghiên cứu các yếu tố đặc trƣng ảnh hƣởng đến quá trình hấp phụ đó vì trong luận án này không đo từng dòng hấp phụ mà đo dòng hòa tan của sản phẩm quá trình hấp phụ . Nhìn chung có ba kiểu hấp phụ đặc trƣng đó là hấp phụ theo kiểu điện hóa, hấp phụ do ái lực hóa học (nhóm chức có khả năng hấp phụ) và hấp phụ đẳng nhiệt. Đối với một số chất hữu cơ, bản thân của các
18
chất đó có những nhóm chức có khả năng hấp phụ lên bề mặt điện cực tại những thế xác định gọi là thế tích lũy (tacc) và đây là một trong những đối tƣợng nghiên cứu mới của phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ đƣợc áp dụng để phân tích các chất hữu cơ có hoạt tính sinh học trong dƣợc phẩm.
1.4.1.2. Giai đoạn dừng
Sau giai đoạn làm giàu là giai đoạn dừng để chất phân bố đều trên bề mặt điện cực làm việc và chuyển dung dịch tƣ̀ tra ̣ng thái đô ̣ng sang tra ̣ng thái tĩnh cho kết quả ghi dòng ổn đi ̣nh hơn.
1.4.1.3. Giai đoạn hòa tan tĩnh
Giai đoạn hòa tan tĩnh là ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật von-ampe nào đó, chẳng hạn: von- ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), khi đó phƣơng pháp đƣợc gọi là von- ampe hòa tan catot hấp phụ xung vi phân (DP-AdSV) [93, 100] hoặc von-ampe sóng vuông (Square Wave - SW) khi đó phƣơng pháp đƣợc gọi là von-ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông (SW-AdSV) [44, 45, 59 79]. Ngƣợc lại, ghi tín hiệu hòa tan bằng cách quét thế theo chiều anot, tức là quét thế dƣơng dần để oxy hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng các kỹ thuật von-ampe. Khi đó phƣơng pháp sẽ có tên go ̣i von-ampe hòa tan anot.
Đối với phƣơng pháp AdSV, tín hiệu hòa tan thu đƣợc có dạng đỉnh, là cơ sở để định lƣợng chất phân tích. Theo Pihlar, Valenta và Nurnbergh [87] tín hiệu von- ampe hòa tan tỉ lệ thuận với nồng độ bề mặt của chất đƣợc hấp phụ trên cực làm việc theo phƣơng trình:
Q = n.F.S.C0
Trong đó, Q (C) là điện lƣợng cần thiết để khử chất điện hoạt đã đƣợc hấp phụ, n là số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng, F (C/mol) là hằng số Faraday, S (cm2) là diện tích bề mặt điện cực và C0 (mol/cm2) là nồng độ bề mặt của chất đƣợc hấp phụ trên điện cực.
19
Với một tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh píc hòa tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q nên Ip tỉ lệ với S và C0. Mà C0 tỉ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C) khi các điều kiê ̣n hấp phu ̣ đƣợc lă ̣p la ̣i, nên Ip tỉ lệ với S và C tức là: Ip S.C. Để đạt đƣợc độ nhạy cao khi phân tích bằng AdSV cần tìm các điều kiện tối ƣu cho quá trình hấp phụ. Do vậy, cƣờng độ dòng phụ thuộc vào một số yếu tố nhƣ loại điện cực, thời gian tích lũy, thế tích lũy, dung môi, đặc tính bề mặt của điện cực, diện tích điện cực, lực ion, pH và nhiệt độ. Vì thế, cƣờng độ dòng Ip = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm, phụ thuộc vào các điều kiện: 1) điều kiện tích lũy (làm giàu) nhƣ thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, nhiệt độ và thành phần dung dịch nhƣ