Đây là phƣơng pháp định lƣợng đơn giản thích hợp cho việc xác định hoạt tính lipaza trong dịch mô thực vật, tụy tạng động vật, phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính enzyme lipaza trong huyết thanh, huyết tƣơng, dịch tá tràng .
Hoạt tính lipaza đƣợc xác định bằng việc trung hòa acid béo tự do đƣợc giải phóng bởi sự thủy phân chất béo của lipaza theo thời gian bằng chất chuẩn NAOH 0.1N, ở nhiệt độ 37°C , pH 8, có sử dụng chất nhũ hóa là gum arabic.
CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Đại học Nha Trang. - Thời gian: đề tài tiến hành từ tháng 03/2013 đến 06/2013
3.2 VẬT LIỆU
Tôm hùm xanh tên khoa học : Panulirus homarus. Nuôi lồng tại vùng nuôi cam ranh Khánh Hoà, đƣợc bắt sống và đƣa về phòng thí nghiệm để ly trích enzyme nội tạng.
Hình 3.1 Tôm hùm xanh (Panulirus. homarus) ở vùng nuôi cam ranh khánh hòa
3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣơng protein trong mẫu enzyme nội tạng trong tôm hùm xanh [5] trong tôm hùm xanh [5]
Mẫu nội tạng tôm hùm bông và tôm hùm xanh sau khi đƣợc trích ly enzyme bằng dung dịch đệm Tris HCl tỷ lệ dung môi/nội tạng : 1/7 (w/v) [8] thu đƣợc dịch chiết enzyme, đem dịch chiết này đi kết tủa bằng etanol 96% tỷ lệ 1/6 (v/v) [8] ly tâm lạnh thu kết tủa ta thu đƣợc chế phẩm enzyme thô từ nội tạng tôm hùm xanh, đem mẫu enzyme thu đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất theo tỷ lệ 1/5 (w/v) và xác định hàm lƣợng
protein bằng phƣơng pháp lowry. Nguyên tắc và phƣơng pháp tiến hành đƣợc trình bày ở phần 1. Phụ lục 1.
3.3.2Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme lipaza trong mẫu enzyme nội tạng
trong tôm hùm xanh[6], [12], [18], [20]
Mẫu enzyme nội tạng trong tôm hùm xanh sau khi xác định hàm lƣợng protein thì ta xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Nguyên tắc và phƣơng pháp tiến hành đƣợc trình bày ở phần 2. Phụ lục 1.
3.3.3 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
3.3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Sơ đồ 3.1 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng hợp quá trình thu nhận enzyme lipaza từ
nội tạng tôm hùm
Giải thích quy trình
+ Tôm hùm xanh (P.homarus) nuôi lồng ở vùng nuôi cam ranh đƣợc bắt sống và đƣa về phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trƣờng đại học nha trang để tiến hành thu
Tôm hùm xanh
Xử lý
Nội tạng tôm hùm xanh
nghiền nhuyễn, đem cân trọng lƣợng
Trích ly enzyme theo tỷ lệ mẫu nội tạng/dung môi: 1/7 (w/v) bằng
Khuấy liên tục bằng máy khuấy từ trong thời gian 60 phút
Ly tâm lạnh nhiệt độ ≤ 4°C, thời gian 15 phút, 6000 vòng/ phút lấy dịch
enzyme
Kết tủa bằng etanol 96%, ly tâm lạnh nhiệt độ ≤ 4°C, thời gian 15 phút,
6000 vòng/ phút thu kết tủa Đệm phosphate Tris HCl Chọn dung môi trích ly thích hợp Enzyme thô Xác định hàm lƣợng protein Xác định hoạt tính enzyme lipaza Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II, độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme lipaza
nhận nội tạng enzyme.
+ Xử lý : Tôm hùm sống đƣợc ngâm trong đá lạnh làm tôm hùm bị sốc nhiệt dẫn đến tê liệt hoạt động sống nhƣng vẫn đảm bảo tôm hùm vẫn còn sống, nhƣ vậy sẽ dễ dàng cho việc thu nhận nội tạng.
Hình 3.2: Ngâm tôm hùm trong đá lạnh làm tê liệt hoạt động sống
Tiến hành mổ đầu và thân tôm hùm để thu nội tạng .Để thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nhất cần phải tiến hành mổ tôm khi còn sống và thu hồi nội tạng ngay sau đó càng nhanh càng tốt.
+ Tôm hùm sau khi xử lý ta thu nội tạng, nội tạng đƣợc nghiền nhuyễn bằng cối và đem đi cân trọng lƣợng, lƣu ý quá trình xử lý, nghiền nhuyễn phải giữ cho nội tạng tôm hùm ở nhiệt độ ≤ 4 °C bằng đá vụn.
Hình 3.4 Nội tạng tôm hùm xanh được nghiễn nhuyễn
+ Trích ly enzyme bằng tris HCl và đệm phosphate : phối trộn nguyên liệu với tris HCl và đệm phosphate theo tỷ lệ 1:7 [8] Trong quá trình này enzyme trong nội tạng sẽ hòa tan và khuếch tán vào dung môi trích ly. Lựa chọn dung môi trích ly thích hợp cho quá trình trích ly.
+ Sau đó đƣa đi khuấy bằng máy khuấy từ trong vòng 60 phút để đồng nhất nội tạng tôm hùm, tạo điều kiện cho quá trình trích ly enzyme.
Hình 3.5 : Đồng nhất nội tạng tôm hùm xanh bằng máy khuấy từ
+ Sau đó đƣa đi ly tâm lạnh, nhiệt độ ly tâm ≤ 4 oC, 6000 vòng/phút trong vòng 15 phút, thu dịch chứa enzyme và loại bỏ tạp chất không hòa tan có chứa trong dịch enzyme.
+ Kết tủa enzyme: để thu nhận enzyme ta dùng dung môi hữu cơ là etanol với nồng độ 96% tỷ lệ 1/6 (v/v) [8] vào dịch enzyme. khi đó kết tủa sẽ xuất hiện, việc kết tủa enzyme này nhằm mục đích loại protein không phải là enzyme, nƣớc, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Thời gian kết tủa enzyme là 60 phút, đảm bảo quá trình kết tủa ở nhiệt độ ≤ 4o
C để tránh sự biến tính enzyme bởi các yếu tố bên ngoài tác động vào.Sau 60 phút đƣa dịch enzyme đã kết tủa đi ly tâm lạnh 6000 vòng/ phút, nhiệt độ ≤ 4 °C. Thời gian 15 phút để thu kết tủa loại dịch.
Hình 3.6 : Kết tủa enzyme bằng etanol và dịch enzyme đã kết tủa sau khi được đưa đi ly tâm lạnh
+ Enzyme thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh (P.homarus) thu đƣợc đem pha loãng bằng nƣớc cất với tỷ lệ 1:5 (w/v) và đêm đi xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp lowry.
+ Sau đó xác định hoạt tính enzyme lipaza của enzyme thô thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh bằng phƣơng pháp chuẩn độ.
+ Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II, độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme lipaza của enzyme thô thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh (P.homarus)
Từ sơ đồ nghiên cứu trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể.
3.3.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi trích ly
Dung môi sử dụng trong trích ly cũng là một nhân tố rất quan trọng quyết định đến hiệu suất trích ly cũng nhƣ hoạt tính enzyme lipaza. Có rất nhiều dung môi dùng để trích ly enzyme tuy nhiên sau khi tham khảo tài liệu quyết định chọn 2 dung môi trích ly là đệm phosphate và tris HCl. Sơ đồ nghiên cứu chọn dung môi trích ly nhƣ sau:
Sơ đồ 3.2 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn dung môi trích ly
Nguyên liệu tôm hùm xanh
Xử lý
Nội tạng tôm hùm
nghiền nhuyễn, đem cân trọng lƣợng
trích ly enzyme theo tỷ lệ mẫu nội tạng/dung môi : 1/7 (w/v)
bằng 2 dung môi
Xác định hàm lƣợng protein của enzyme thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh bằng phƣơng pháp lowry
Xác định hoạt tính enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh
bằng phƣơng pháp chuẩn độ Đệm phosphate Tris HCl
Chọn dung môi trích ly thích hợp
3.3.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme lipaza đƣợc nghiên cứu bằng cách xác định hoạt tính của enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ ở những nhiệt độ khác nhau: 10o C, 20o C, 30 o C, 40 o C, 50 o C, 60o C, 70 o C. Mẫu enzyme thô đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất (tỷ lệ 1:5(w/v)).Sơ đồ bố trí thí nghiệm nhƣ sau:
Sơ đồ 3.3 : Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme lipaza
Mẫu enzyme thô từ nội tạng tôm hùm pha loãng bằng nƣớc cất tỷ lệ
1:5(w/v)
Ủ mẫu enzyme ở các nhiệt độ khác nhau sau
20o C 30 o C 40 o C 50 o C 60o C 70 o C
Xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Kết luận về nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme lipaza
3.3.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh từ nội tạng tôm hùm xanh
pH ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính enzyme, mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị pH tối ƣu nhất. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính của enzyme đƣợc nghiên cứu bằng cách xác định hoạt tính của enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ ở nhiệt độ tối thích với pH khác nhau : 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Mẫu enzyme thô đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất (tỷ lệ 1:5(w/v)). Sơ đồ bố trí thí nghiệm nhƣ sau:
Sơ đồ 3.4 : bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lipaza
Mẫu enzyme thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh pha loãng bằng
nƣớc cất tỷ lệ 1/5(w/v)
Ủ mẫu ở nhiệt độ tối ƣu với các pH khác nhau sau
2 3 4 5 6 7 8
Xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn
độ
Kết luận về pH hoạt động tối thích của enzyme lipaza
3.3.3.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của Ion kim loại hóa trị 2 đến hoạt tính lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
Để xác định ảnh hƣởng của các ion kim loại II đến hoạt tính của enzyme, mẫu enzyme thô đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất (tỷ lệ 1:5(w/v)) sẽ đƣợc ủ với các ion: Ca2+, Mg2+, Hg2+, Zn2+ và Cu2+ ở nồng độ 1mM và 5 mM. Và một mẫu không có sự có mặt của ion kim loại sau đó xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nhƣ sau:
Sơ đồ 3.5 : bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính enzyme lipaza
Mẫu enzyme thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh pha loãng bằng nƣớc
cất tỷ lệ 1/5(w/v)
Ủ mẫu với các ion kim loại hóa trị 2 khác nhau(1mM, 5mM) ở nhiệt độ
tối thích, pH tối thích
Xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Ca2+ Mg2+ Hg2+ Zn2+ Cu2+ Không có ion kim loại
Kết luận về ảnh hƣởng của ion kim loại hóa trị 2
3.3.3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh tạng tôm hùm xanh
Để xác định độ bền nhiệt của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh, mẫu enzyme thô đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất (tỷ lệ 1:5(w/v)) sẽ đƣợc ủ ở các nhiệt độ : 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút. Sau đó đem tất cả các mẫu này đƣa về ủ ở nhiệt độ tối ƣu là 30°C, rồi xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nhƣ sau:
Sơ đồ 3.6 : Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của enzyme lipaza
Mẫu enzyme thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh pha loãng bằng nƣớc cất tỷ lệ 1/5(w/v)
Ủ mẫu ở các nhiệt độ sau trong 30 phút
Tiếp tục ủ tất cả các mẫu này ở nhiệt độ tối thích là 30°C, với cơ chất nhũ
tƣơng dầu
Xác định hoạt tính lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ
Kết luận về độ bền nhiệt của enzyme lipaza
3.4 PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các số liệu trong đề tài đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm Microsoft office Excel 2007 và phần mềm xử lý thống kê SPSS.
3.5 CÁC THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM CHỦ YẾU ĐÃ ĐƢỢC SỬ DỤNG
+ Cân điện tử độ chính xác 10-4 (g) và cân phân tích + Máy khuấy từ
+ Máy ly tâm lạnh
+ Máy đo quag phổ UV-VIS + Thiết bị đồng hóa cơ học + Máy đo pH
CHƢƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 XÁC ĐỊNH DUNG MÔI TRÍCH LY
Mẫu nội tạng tôm hùm xanh đƣợc nghiền nhuyễn, tiến hành trích ly bằng 2 dung môi là đệm phosphate (pH: 8) và tris HCl (pH :8) ở tỉ lệ mẫu / dung môi : 1/7 (w/v)[8]. Khuấy đảo liên tục bằng máy khuấy từ trong vòng 60 phút, ly tâm thu dịch chiết, kết tủa bằng etanol, sau đó ly tâm thu kết tủa ta đƣợc enzyme. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza của từng mẫu. Tiến hành so sánh khả năng tách chiết của từng loại dung môi ở tỷ lệ thích hợp để chọn ra dung môi chiết protein-enzyme thích hợp. Kết quả trình bày trong bảng 2.1 phụ lục 2. và đồ thị 4.1 dƣới đây
Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng protein và hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh
Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy khả năng chiết của dung môi khác nhau ảnh hƣởng đến hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh.
Đối với mẫu nội tạng tôm hùm xanh thì dung môi trích ly Tris-HCl cho kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza tốt nhất.
Dung môi Tris-HCl cho kết quả trích ly enzyme tốt nhất là do enzyme lipaza ổn định trong dung môi này, dung môi Tris-HCl đảm bảo đƣợc pH của môi trƣờng phù hợp cho sự trích ly enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh.
Nhƣ vậy chọn dung môi trích ly là đệm Tris-HCl pH : 8 với tỉ lệ đệm Tris HCl/mẫu: 1/7(w/v) để thu dịch chiết sử dụng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN TRONG MẪU ENZYEM TỪ NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH TẠNG TÔM HÙM XANH
Nôi tạng tôm hùm xanh đƣợc trích ly enzyme bằng đệm tris HCl với tỷ lệ Mẫu/ tris HCl :1/7 (w/v), kết tủa bằng etanol 96% tỷ lệ 1/6(v/v), ta thu đƣợc enzyme thô, đem enzyme thô đi xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp lowry. Xây dựng đƣờng chuẩn albumin kết quả đƣợc trình bày trong bảng 2.2 phụ lục 2 và đồ thị 4.2 dƣới đây:
Dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 1.7272x + 01157 ta tính đƣợc hàm lƣợng protein (mg/ml) của mẫu enzyme thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh.
Gọi hàm lƣợng protein trong từng mẫu enzyme là X(mg/ml) , OD (hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thí nghiệm enzyme với mẫu đối chứng ) ta có :
X = 7272 . 1 1157 . 0 OD
Kết quả đo mật độ quang OD trên thiết bị đo quang phổ UV_VIS, OD = ODmẫuthí nghiệm- ODmẫu đối chứng và hàm lƣợng protein của mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh (3 mẫu thí nghiệm ) đƣợc thể hiện ở bảng 4.1 dƣới đây:
Bảng 4.1 : Hàm lượng protein mẫu nội tạng tôm hùm xanh
Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm 1 Mẫu thí nghiệm 2 Mẫu thí nghiệm 3 OD 0.0753 3.435 3.567 3.451 OD 3.3597 3.4917 3.3757 Hàm lƣợng protein X (mg/ml) 1.879 1.955 1.89
Hàm lƣợng protein của enzyme nội tạng tôm hùm xanh (HLPTHX ) là giá trị trung bình của hàm lƣợng protein 3 mẫu thí nghiệm enzyme nội tạng tôm hùm xanh :
HLPTHX = 3 89 . 1 955 . 1 879 . 1 = 1.908(mg/ml)
4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPAZA THU NHẬN TỪ NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH TẠNG TÔM HÙM XANH
Hoạt tính mẫu enzym thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả xác định hoạt tính enzyme lipaza đƣợc trình bày trong bảng 4.2 dƣới đây :
Bảng 4.2 : Hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
Mẫu Lƣợng NaOH 0.1 N tiêu tốn(ml) Hoạt tính enzymelipaza (µmol/h.ml)
Hoạt tính riêng enzyme lipaza
(µmol/h.mg) Mẫu thí nghiệm Mẫu trắng
Lần 1 0.26 0.52 13
13.17±0.289 6.903±0.289 Lần 2 0.24 0.51 13.5
Lần 3 0.24 0.50 13
Vậy hoạt tính của enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ là 6.903±0.289 (µmol/h.mg).
4.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME LIPAZA THU NHẬN TỪ NÔI TẠNG TÔM HÙM XANH NHẬN TỪ NÔI TẠNG TÔM HÙM XANH
4.4.1 Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh nội tạng tôm hùm xanh
1/ 5 (w/v) nhiệt độ ủ thay đổi lần lƣợt là : 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C. xác định hoạt tính lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả xác định hoạt tính đƣợc