Để xác định độ bền nhiệt của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh, mẫu enzyme thô đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất (tỷ lệ 1:5(w/v)) sẽ đƣợc ủ ở các nhiệt độ nhƣ sau : 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút. Sau đó đem tất cả các mẫu này đƣa về ủ ở nhiệt độ tối ƣu là 30°C rồi xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 2.7 phụ lục 2 và đồ thị 4.7 dƣới đây:
Đồ thị 4.7: Sự biến thiên của hoạt tính tương đối (% so với cực đại) của lipaza khi xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau.
Nhận xét: từ đồ thị 4.7 cho thấy
Khi xử lý nhiệt enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm ở các nhiệt độ 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút rồi mới tiến hành xác định hoạt tính lipaza ở nhiệt độ tối ƣu là 30°C thì hoạt tính lipaza đều giảm tuyến tính. Mức độ giảm tùy thuộc vào nhiệt độ. Khi xử lý nhiệt ở nhiệt độ 70°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh giảm mạnh và rõ rệt chỉ còn 12.31 % so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C. Khi xử lý nhiệt ở 60°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza giảm còn 38,46% so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C. Khi xử lý nhiệt ở 50°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza giảm còn 46.15% so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C. Khi xử lý nhiệt ở 40°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza giảm nhẹ còn 75,38% so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C.
Sự giảm tuyến tính của hoạt tính lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh khi xử lý nhiệt ở các nhiệt độ 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút là do dƣới tác dụng của
nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣởng tới hoạt tính. Nhiệt độ có thể làm cho một số liên kết hydrogen trong mạng lƣới liên kết hydrogen tham gia vào việc giữ vững cấu trúc của enzyme bị đứt gãy. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào nhiệt độ xử lý, nhiệt độ càng cao thì mức độ ảnh hƣởng càng lớn. Đối với enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh thì khi nhiệt độ xử lý 70°C trong 30 phút thì enzyme thể hiện hoạt tính rất yếu.
Kết quả trên cho thấy enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh là một enzyme kém bền nhiệt, không thể bảo quản bình thƣờng ở nhiệt độ phòng, khi bảo quản ở nhiệt độ phòng thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh giảm rất nhanh và mạnh mẽ.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu rút ra một số kết luận nhƣ sau:
1. Xác định đƣợc dung môi thích hợp cho quá trình trích ly, thu nhận enzyme thô từ nội tạng tôm hùm xanh nhƣ sau:
-Dung môi tách chiết: đệm Tris-HCl pH :8 với tỷ lệ mẫu/dung dịch Tris-HCl :1/7 (w/v) thích hợp nhất để thu nhận enzyme từ nội tạng tôm hùm xanh .
- Kết tủa bằng etanol 96% tỷ lệ mẫu/ etanol là 1/6(v/v).
2. Xác định đƣợc hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh.
3. Xác định đƣợc một số tính chất enzyme lipaza nhƣ sau:
- Yếu tố nhiệt độ và pH ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh. Enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh có pHopt là 6 và topt là 30°C.
- Yếu tố ion kim loại hóa trị II ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh. Ở nồng độ 1 mM Ion ca2+ làm tăng hoạt tính của enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh còn các ion kim loại Mg2+ , Zn2+, Hg2+, Cu2+ đều làm giảm hoạt tính của enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh. Ở nồng độ 5mM tất cả các ion kim loại ca2+, Mg2+, Zn2, Hg2+, Cu2+ đều làm giảm hoạt tính của enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh.
Đề xuất ý kiến
Qua quá trình nghiên cứu em xin phép có một số ý kiến đề xuất nhƣ sau: - Tối ưu hóa quá trình trích ly thu nhận enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh. - Tối ưu hóa quá trình kết tủa thu nhận enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh.
- Cần nghiên cứu tiếp tục tìm biện pháp thu nhận enzyme tinh sạch hơn và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza sau tinh sạch để có cách bảo quản chế phẩm enzyme tinh sạch một cách thích hợp.
- Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của lipaza trong hệ tiêu hóa tôm hùm để góp phần bảo quản tôm hùm sau thu hoạch một cách hiệu quả hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1993),
Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Hữu Chấn (1983), Enzyme và xúc tác sinh học, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
3. Nguyễn Lệ Hà (2010), Nghiên cứu tách chiết và ứng dụng enzyme protease từ tôm sú Penaeus Monodon vào chế biến thủy sản, Luận án tiến sĩ kỷ thuật, Thƣ viện đại học Nha Trang.
4. Nguyễn Hoài Hƣng, Bùi Văn Thế Vinh (2009), Bài giảng thực hành hóa sinh, Trƣờng đại học kỷ thuật công nghệ TP.Hồ Chí Minh.
5. Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Thuần Anh, Vũ Ngọc Bội (2010), Phân tích kiểm nghiệm thực phẩm thủy sản, Nhà xuất bản Khoa học và kỷ thuật.
6. Trần Thị Bé Lan, Nguyễn Minh Nam, Tạ thị Thanh Thủy, Phan Ngọc Hòa (2012), “So sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipaza từ candida rugosa và porcine pancreas”, Tạp chí khoa học 2012: 22b 210-220.
7. Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Cƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hƣơng, Phan Thị huyền, Tạ Thu Hằng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Văn Nam (2007) , Tách chiết tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú, Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nông Lâm T.P Hồ Chí Minh, T.P Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Sĩ Lê Thanh, Quyền Đình Thi(2007), “Một số tính chất hóa lý của lipaza ngoại bào chủng Geotrichum sp.DTQ-26.3”, Tạp chí công nghệ sinh học 5(1): 31-40. 10. Đinh Tấn Thiện (2004), “Kỹ thuật ƣơng nuôi tôm hùm giống ở vùng biển Sông
(1984 – 2004), Viện Nghiên cứu thuỷ sản 3, NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, tr. 59-72.
11.Đặng Thị Thu, Ngô Tiến Hiển, Quyền Đình Thi, Phùng Thị Thủy, Hoàng Lan, Đỗ Biên Cƣơng, Thiều Linh Thùy và Nguyễn Thị Sánh (2004), Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo bằng lipaza, Đề tài nhánh của nghiên cứu cấp nhà nƣớc mã số: KC 04-07, Viện CN Thực Phẩm, 301, Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội.
Tiếng anh
12.Leon C.Chesley, The concentrations of protease, amylase and lipase in certain marine fisher, Biol. Bull, in press.
13.Beisson.F, et al(2000), “ Methods for lipase detection and assay: a critical review”,
Eur. J. Lipid Sci. Technol, 133–153.
14.M.A. Islam, F. Parveen, K. Hossain, S. Khatun, Md. R. Karim, G.S. Kim, N. Absar, Md. S. Haque (2009), “Purification and Biochemical Characterization of Lipase from the Dorsal Part of Cirrhinus reba”, Thai Journal of Agricultural Science, 42(2), 71-80. 15.M.A. Islam, N.Absar, Abdus. Salam Bhuiyan (2008), “Isolation Purification and
characterziation of lipase from grey mullet”, Asian Journal of biochemistry, 3(4), 243- 255.
16.Lima,V.M.G, N. Krieger, D.A. Mitchell, J.D. Fontana( 2004), “Activity and stability of a crude lipase from Penicillium aurantiogriseum in aqueous media and organic solvents”, Biochem. Eng. J, 18, 65-71.
17.J. Nayak, P.G.V.Nair, S.Mathew, K.Ammu (2004), “ A Study on the Intestinal Lipase of Indian Major Carp Labeo rohita”, Asian Fisheries Science, 333-340.
18.Benedetto Savona, Cecilia Tramati, Antonio Mazzola (2011), “Digestive Enzymes in Larvae and Juveniles of Farmed Sharpsnout Seabream (Diplodus puntazzo) (Cetti, 1777)”, The Open Marine Biology Journal, 5, 47-57.
19.Roderick P. MacDonald, Royal O. Lefave, “Serum Lipase Determination with an Olive Oil Substrate Using an Three-Hour Incubation Period”, Vol. 8, No. 5, 1962.
20.Tietz. NW, Fiereck .EA(1966), “ A specific method for serum lipase determination”,
Clin Chem Acta; 13: 352-8.
21.Abbas, H., A. Hiol, V. Deyris, L. Comeau (2002), “Isolation and characterization of an extracellular lipase from Mucor sp strain isolated from palm fruit” Enzyme Microb. Technol., 31, 968-975.
22.Raso, B.A, H.O. Hultin (1988), A comparison of dogfish and porcine pancreatic lipases, Comp. Biochem. Physiol, 89B, 671-677.
23.Borlongan, I.G (1990), Studies on the digestive lipases of milkfish, Chanos chanos. Aquaculture, 89, 315-25.
Trang web
24. http://kythuatnuoitrong.com/dac-diem-sinh-hoc-tom-hum/#more-170 25. http://www.agroviet.gov.vn/pages/news_detail.aspx?NewsId=13573 26. http://www.vncreatures.net/chitiet.php?page=3&loai=1&ID=5825
PHỤ LỤC Phụ lục 1 : Một số phƣơng pháp nghiên cứu
1. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp lowry [5]
Nguyên tắc
Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp
photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 660nm.Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu.
Hoá chất cần dùng
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2%) pha trong 1000ml nƣớc cất. - Dung dịch B: 0.5g CuSO4.5H2O (0.5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trƣớc khi dùng). - Thuốc thử folin, trƣớc khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N.
- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml. 0.25g albumin pha trong 250ml nƣớc cất Cách tiến hành
-Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0.5ml dịch chứa protein với hàm lƣợng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút. Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0.25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cƣờng độ màu cực đại.
- Đem hỗn hợp đi đo OD ( mật độ quang) bằng máy đo quang phổ UV-VIS ở bƣớc sóng 660nm . Xác định đƣợc trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu . Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình .
- Mẫu đối chứng: 0.5ml nƣớc cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và bƣớc tiếp theo đƣợc tiến hành nhƣ mẫu thí nghiệm.
Xây dựng đƣờng đồ thị chuẩn
Hàm lƣợng protein tan trong dung dịch đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn Cân 0.25 g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 250 ml nƣớc, ta đƣợc dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nƣớc cất với các nồng độ theo bảng sau:
ống số 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ protein (mg/ml) 0.02 0.04 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 Dung dịch albumin(1mg/ml) 0.1 0.2 0.5 0.75 1 1.5 2 Nƣớc cất (ml) 4.9 4.8 4.5 4.25 4 3.5 3
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0.5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng nhƣ trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút rồi cho 0.25ml thuốc thử folin (1N) lắc đều và để yên trong vòng 20 phút. Sau đó đêm đi đo OD (mật độ quang) ở bƣớc sóng 660nm. -Mẫu đối chứng: lấy 0.5 ml nƣớc cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bƣớc tiếp theo đƣợc tiến hành nhƣ mẫu thí nghiệm .Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đƣờng hồi quy. Kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê thông thƣờng. Hàm lƣợng protein : Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu.
2. Xác định hoạt tính enzyme lipaza theo phƣơng pháp chuẩn độ [6], [12], [18], [20]
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ titrimetry Nguyên tắc
Hoạt tính enzyme lipaza đƣợc biểu thị là số µmol axit béo sinh ra do sự thủy phân chất béo của enzyme lipaza có trong 1ml dịch trong 1h ở nhiệt độ 37° C , pH : 8. Có sử dụng chất nhũ hóa gum arabic.
Hóa chất
- Nhũ tƣơng dầu: cho 100ml nƣớc cất vào bình tam giác 250ml bổ sung 7g gum arabic, 0.2g Natri benzoat hòa trộn cho đến khi tan hoàn toàn, cho từ từ 100ml dầu oliu vào, sau đó đem đi đồng hóa cơ học trong 10 phút, bảo quản trong tủ lạnh tránh lạnh đông và nơi nhiệt độ cao, lắc kỷ trƣớc khi sử dụng, không sử dụng nếu nhƣ hệ nhũ tƣơng bị tách pha sau khi lắc.
- chất chỉ thị phenolphtalein 0.1% : hòa tan 1g phenolphtalein trong cồn 95% và định mức lên 100ml bằng côn 95% .
- Tris HCl pH 8
- Dung dịch NAOH chuẩn 0.1N - cồn 95%
Cách tiến hành
Cho thêm vài giọt chất chỉ thị phenolphtalein rồi chuẩn độ đến giá trị pH 10.5 (dung dịch có màu hồng).
tính kết quả
công thức tính hoạt tính lipaza (HTL)
= V2- V1 là thể tích NAOH 0,1N dùng điều chỉnh (ml) V1 là thể tích NAOH dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng (ml) V2 là thể tích NAOH dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml) Vmau là thể tích của enzyme(ml)
N là nồng độ đƣơng lƣợng của NAOH(N) t là thời gian enzyme xúc tác thủy phân (h) hoạt tính riêng của enzyme lipaza(HTRL)
Mẫu thí nghiệm Mẫu đối chứng
Dung dịch đệm tris HCl pH 8(ml) 1.25 1.25 Nhũ tƣơng dầu (ml) 2 2 Dịch enzyme lipaza(ml) 1 1 Cồn 95 % 0 1.5 ủ 2h ở 37°C Cồn 95 % 1.5 0 Nƣớc cất (ml) 3 3
Trong đó :
HTL là hoạt tính của enzyme lipaza
Cp nồng độ protein trong dịch chứa enzyme
Phụ lục 2 : Kết quả nghiên cứu tách chiết, thu nhận và một số tính chất của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
1. xác định dung môi trích ly
Bảng 2.1 : Ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng protein và hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
2 Xây dựng đƣờng chuẩn albumin
Bảng 2.2 kết quả xây dựng đường chuẩn albumin
Hàm lƣợng protein (mg/ml) 0 0.02 0.04 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 OD 0.0073 0.1316 0.1849 0.3026 0.3988 0.498 0.6443 0.7908 OD 0.1243 0.1776 0.2953 0.3915 0.4907 0.637 0.7835 Dung môi trích ly
Lƣợng NAOH 0.1 N tiêu tốn(ml) Hoạt tính enzymelipaza
(µmol/h.ml)
Hàm lƣợng protein (mg/ml) Mẫu thí nghiệm Mẫu trắng
Tris HCl 0.54 0.35 13.5 1.858 Đệm
3 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh
Bảng 2.3 yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh
Nhiệt độ Lƣợng NAOH 0.1N tiêu tốn Hoạt tính enzyme lipaza(µmol/h.ml) Hoạt độ tƣơng đối(% so với cực đại) Mẫu thí nghiệm(ml) Mẫu đối chứng(ml) 10°C Lần 1 0.39 0.34 2.5 2.5b 15.38 Lần 2 0.39 0.34 2.5 20°C Lần 1 0.45 0.33 6 5.75± 0.354e 35.38 Lần 2 0.45 0.34 5.5 30°C Lần 1 0.64 0.31 16.5 16.25± 0.354g 100 Lần 2 0.65 0.33 16 40°C Lần 1 0.53 0.32 10.5 10.75±0.354f 66.15 Lần 2 0.53 0.31 11 50°C Lần 1 0.4 0.3 5 4.75±0.354d 29.23 Lần 2 0.4 0.31 4.5 60°C Lần 1 0.39 0.31 4 3.75±0.354c 23.08 Lần 2 0.37 0.3 3.5 70°C Lần 1 0.3 0.3 0 0a 0 Lần 2 0.3 0.3 0
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa theo phân tích thống kê SPSS (α= 0,05).
4 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh
Bảng 2.4 : yếu tố pH ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh
pH
Lƣợng NAOH 0.1N tiêu tốn Hoạt tính enzyme lipaza(µmol/h.ml) Mẫu thí nghiệm(ml) Mẫu đối
chứng(ml) 2 Lần 1 1.85 1.8 2.5 1.25±1.768a Lần 2 1.8 1.8 0 3 Lần 1 1.61 1.45 8 8.25±0.354b Lần 2 1.6 1.43 8.5 4 Lần 1 1.21 1 10.5 10.25±0.354c Lần 2 1.2 1 10 5 Lần 1 1.1 0.81 14.5 14.75±0.354e Lần 2 1.1 0.8 15 6 Lần 1 0.92 0.55 18.5 18± 0.707f Lần 2 0.9 0.55 17.5 7 Lần 1 0.7 0.45 12.5 12.75±0.354d Lần 2 0.72 0.46 13 8 Lần 1 0.61 0.35 13 12.75±0.354d Lần 2 0.62 0.37 12.5
*Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa theo phân tích thống kê SPSS (α= 0,05).
5 Ảnh hƣởng Ion kim loại hóa trị II đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ