Sơ đồ 3.1 : Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng hợp quá trình thu nhận enzyme lipaza từ
nội tạng tôm hùm
Giải thích quy trình
+ Tôm hùm xanh (P.homarus) nuôi lồng ở vùng nuôi cam ranh đƣợc bắt sống và đƣa về phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trƣờng đại học nha trang để tiến hành thu
Tôm hùm xanh
Xử lý
Nội tạng tôm hùm xanh
nghiền nhuyễn, đem cân trọng lƣợng
Trích ly enzyme theo tỷ lệ mẫu nội tạng/dung môi: 1/7 (w/v) bằng
Khuấy liên tục bằng máy khuấy từ trong thời gian 60 phút
Ly tâm lạnh nhiệt độ ≤ 4°C, thời gian 15 phút, 6000 vòng/ phút lấy dịch
enzyme
Kết tủa bằng etanol 96%, ly tâm lạnh nhiệt độ ≤ 4°C, thời gian 15 phút,
6000 vòng/ phút thu kết tủa Đệm phosphate Tris HCl Chọn dung môi trích ly thích hợp Enzyme thô Xác định hàm lƣợng protein Xác định hoạt tính enzyme lipaza Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II, độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme lipaza
nhận nội tạng enzyme.
+ Xử lý : Tôm hùm sống đƣợc ngâm trong đá lạnh làm tôm hùm bị sốc nhiệt dẫn đến tê liệt hoạt động sống nhƣng vẫn đảm bảo tôm hùm vẫn còn sống, nhƣ vậy sẽ dễ dàng cho việc thu nhận nội tạng.
Hình 3.2: Ngâm tôm hùm trong đá lạnh làm tê liệt hoạt động sống
Tiến hành mổ đầu và thân tôm hùm để thu nội tạng .Để thu đƣợc enzyme có hoạt tính cao nhất cần phải tiến hành mổ tôm khi còn sống và thu hồi nội tạng ngay sau đó càng nhanh càng tốt.
+ Tôm hùm sau khi xử lý ta thu nội tạng, nội tạng đƣợc nghiền nhuyễn bằng cối và đem đi cân trọng lƣợng, lƣu ý quá trình xử lý, nghiền nhuyễn phải giữ cho nội tạng tôm hùm ở nhiệt độ ≤ 4 °C bằng đá vụn.
Hình 3.4 Nội tạng tôm hùm xanh được nghiễn nhuyễn
+ Trích ly enzyme bằng tris HCl và đệm phosphate : phối trộn nguyên liệu với tris HCl và đệm phosphate theo tỷ lệ 1:7 [8] Trong quá trình này enzyme trong nội tạng sẽ hòa tan và khuếch tán vào dung môi trích ly. Lựa chọn dung môi trích ly thích hợp cho quá trình trích ly.
+ Sau đó đƣa đi khuấy bằng máy khuấy từ trong vòng 60 phút để đồng nhất nội tạng tôm hùm, tạo điều kiện cho quá trình trích ly enzyme.
Hình 3.5 : Đồng nhất nội tạng tôm hùm xanh bằng máy khuấy từ
+ Sau đó đƣa đi ly tâm lạnh, nhiệt độ ly tâm ≤ 4 oC, 6000 vòng/phút trong vòng 15 phút, thu dịch chứa enzyme và loại bỏ tạp chất không hòa tan có chứa trong dịch enzyme.
+ Kết tủa enzyme: để thu nhận enzyme ta dùng dung môi hữu cơ là etanol với nồng độ 96% tỷ lệ 1/6 (v/v) [8] vào dịch enzyme. khi đó kết tủa sẽ xuất hiện, việc kết tủa enzyme này nhằm mục đích loại protein không phải là enzyme, nƣớc, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Thời gian kết tủa enzyme là 60 phút, đảm bảo quá trình kết tủa ở nhiệt độ ≤ 4o
C để tránh sự biến tính enzyme bởi các yếu tố bên ngoài tác động vào.Sau 60 phút đƣa dịch enzyme đã kết tủa đi ly tâm lạnh 6000 vòng/ phút, nhiệt độ ≤ 4 °C. Thời gian 15 phút để thu kết tủa loại dịch.
Hình 3.6 : Kết tủa enzyme bằng etanol và dịch enzyme đã kết tủa sau khi được đưa đi ly tâm lạnh
+ Enzyme thô tách chiết từ nội tạng tôm hùm xanh (P.homarus) thu đƣợc đem pha loãng bằng nƣớc cất với tỷ lệ 1:5 (w/v) và đêm đi xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp lowry.
+ Sau đó xác định hoạt tính enzyme lipaza của enzyme thô thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh bằng phƣơng pháp chuẩn độ.
+ Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại hóa trị II, độ bền nhiệt đến hoạt tính enzyme lipaza của enzyme thô thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh (P.homarus)
Từ sơ đồ nghiên cứu trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể.