Đã có rất nhiều thí nghiệm đƣợc triển khai nhằm tìm hiểu cấu trúc của lipaza trong đó cấu trúc ba chiều của lipaza đƣợc coi là cơ sở để hiểu đƣợc phản ứng động học,đặc hiệu cơ chất, tiên đoán những đặc điểm sinh hoá và hoạt động của lipaza tại bềmặt phân pha dầu nƣớc. Lipaza từ Rhizomun miehei là enzym thuỷ phân đầu tiên có cấu trúc bậc 3 đƣợc xác định bởi tinh thể học tia X. Dùng phƣơng pháp tia X đã phát hiện cấu trúc α/β. Liên kết β song song làm cầu nối với cấu trúc xoắn ốc α để hình thành cấu trúc phức tạp. Các cầu disunfua đƣợc tìm thấy trong phân tử.
Lipaza nhằm làm ổn định cấu trúc gấp nếp của enzym. Trong cấu trúc này protein hình cầu chứa một nhân kị nƣớc tạo nên một chuỗi không cực ở cạnh có ý nghĩa quan trọng cho sự ổn định phân tử. Bên cạnh đó còn có vài nhóm có cực và những phân tử đƣợc liên kết. Sự có mặt của những phân tử nƣớc đã làm tăng lực liên kết của Vander Wall và lực phân tán trong nhân, vì vậy sự ổn định về cấu trúc không gian của phân tử enzym đƣợc tăng lên. Tâm hoạt động của lipaza là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/ Glutamate. Vị trí hoạt động của mọi lipaza đều có Ser, His và Asp (hoặc Glu) và hoàn toàn bị che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo bởi một hoặc hai chuỗi xoắn. Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nƣớc đƣợc hình thành sau khi lipaza đƣợc hoạt hóa, đầu kị nƣớc bao quanh trung tâm hoạt động. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipaza từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid.
Hình 2.4 : Mô hình enzyme lipaza và Cấu trúc không gian của lipaza từ C.rugosa