+ Cân điện tử độ chính xác 10-4 (g) và cân phân tích + Máy khuấy từ
+ Máy ly tâm lạnh
+ Máy đo quag phổ UV-VIS + Thiết bị đồng hóa cơ học + Máy đo pH
CHƢƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 XÁC ĐỊNH DUNG MÔI TRÍCH LY
Mẫu nội tạng tôm hùm xanh đƣợc nghiền nhuyễn, tiến hành trích ly bằng 2 dung môi là đệm phosphate (pH: 8) và tris HCl (pH :8) ở tỉ lệ mẫu / dung môi : 1/7 (w/v)[8]. Khuấy đảo liên tục bằng máy khuấy từ trong vòng 60 phút, ly tâm thu dịch chiết, kết tủa bằng etanol, sau đó ly tâm thu kết tủa ta đƣợc enzyme. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza của từng mẫu. Tiến hành so sánh khả năng tách chiết của từng loại dung môi ở tỷ lệ thích hợp để chọn ra dung môi chiết protein-enzyme thích hợp. Kết quả trình bày trong bảng 2.1 phụ lục 2. và đồ thị 4.1 dƣới đây
Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của dung môi trích ly đến hàm lượng protein và hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh
Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy khả năng chiết của dung môi khác nhau ảnh hƣởng đến hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh.
Đối với mẫu nội tạng tôm hùm xanh thì dung môi trích ly Tris-HCl cho kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme lipaza tốt nhất.
Dung môi Tris-HCl cho kết quả trích ly enzyme tốt nhất là do enzyme lipaza ổn định trong dung môi này, dung môi Tris-HCl đảm bảo đƣợc pH của môi trƣờng phù hợp cho sự trích ly enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh.
Nhƣ vậy chọn dung môi trích ly là đệm Tris-HCl pH : 8 với tỉ lệ đệm Tris HCl/mẫu: 1/7(w/v) để thu dịch chiết sử dụng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN TRONG MẪU ENZYEM TỪ NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH TẠNG TÔM HÙM XANH
Nôi tạng tôm hùm xanh đƣợc trích ly enzyme bằng đệm tris HCl với tỷ lệ Mẫu/ tris HCl :1/7 (w/v), kết tủa bằng etanol 96% tỷ lệ 1/6(v/v), ta thu đƣợc enzyme thô, đem enzyme thô đi xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp lowry. Xây dựng đƣờng chuẩn albumin kết quả đƣợc trình bày trong bảng 2.2 phụ lục 2 và đồ thị 4.2 dƣới đây:
Dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 1.7272x + 01157 ta tính đƣợc hàm lƣợng protein (mg/ml) của mẫu enzyme thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh.
Gọi hàm lƣợng protein trong từng mẫu enzyme là X(mg/ml) , OD (hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thí nghiệm enzyme với mẫu đối chứng ) ta có :
X = 7272 . 1 1157 . 0 OD
Kết quả đo mật độ quang OD trên thiết bị đo quang phổ UV_VIS, OD = ODmẫuthí nghiệm- ODmẫu đối chứng và hàm lƣợng protein của mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh (3 mẫu thí nghiệm ) đƣợc thể hiện ở bảng 4.1 dƣới đây:
Bảng 4.1 : Hàm lượng protein mẫu nội tạng tôm hùm xanh
Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm 1 Mẫu thí nghiệm 2 Mẫu thí nghiệm 3 OD 0.0753 3.435 3.567 3.451 OD 3.3597 3.4917 3.3757 Hàm lƣợng protein X (mg/ml) 1.879 1.955 1.89
Hàm lƣợng protein của enzyme nội tạng tôm hùm xanh (HLPTHX ) là giá trị trung bình của hàm lƣợng protein 3 mẫu thí nghiệm enzyme nội tạng tôm hùm xanh :
HLPTHX = 3 89 . 1 955 . 1 879 . 1 = 1.908(mg/ml)
4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPAZA THU NHẬN TỪ NỘI TẠNG TÔM HÙM XANH TẠNG TÔM HÙM XANH
Hoạt tính mẫu enzym thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả xác định hoạt tính enzyme lipaza đƣợc trình bày trong bảng 4.2 dƣới đây :
Bảng 4.2 : Hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
Mẫu Lƣợng NaOH 0.1 N tiêu tốn(ml) Hoạt tính enzymelipaza (µmol/h.ml)
Hoạt tính riêng enzyme lipaza
(µmol/h.mg) Mẫu thí nghiệm Mẫu trắng
Lần 1 0.26 0.52 13
13.17±0.289 6.903±0.289 Lần 2 0.24 0.51 13.5
Lần 3 0.24 0.50 13
Vậy hoạt tính của enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ là 6.903±0.289 (µmol/h.mg).
4.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME LIPAZA THU NHẬN TỪ NÔI TẠNG TÔM HÙM XANH NHẬN TỪ NÔI TẠNG TÔM HÙM XANH
4.4.1 Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh nội tạng tôm hùm xanh
1/ 5 (w/v) nhiệt độ ủ thay đổi lần lƣợt là : 10°C, 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C. xác định hoạt tính lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả xác định hoạt tính đƣợc trình bày ở bảng 2.3 và đồ thị 4.3 dƣới đây:
Đồ thị 4.3 : Yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh
Nhận xét : từ đồ thị 4.3 Cho thấy enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh đạt hoạt tính cực đại ở nhiệt độ 30°C.
Ở nhiệt độ thấp 10°C enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh vẫn còn hoạt tính 15.38% so với nhiệt độ thich hợp khi enzyme lipaza đạt hoạt tính cực đại.Kết quả này giúp cho ta hiểu đƣợc tại sao sau khi thu hoạch tôm hùm xanh và trong quá trình chế biến tôm qui định bảo quản ở nhiệt độ thấp. Nếu nhiệt độ cao hơn 10°C thời gian bảo quản sẽ giảm rất nhanh.
Khi nhiệt độ tăng cao hơn 10°C thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh tăng nhanh rõ rệt.
Khi nhiệt độ tăng đến 30°C thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh(16.25(µmol/h.ml)) đạt cực đại.
Khi nhiệt độ tăng cao hơn nhiệt độ tối ƣu thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh giảm nhanh và rõ rệt.
Khi nhiệt độ tăng đến 70°C thì enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh mất hoạt tính hoàn toàn. Vậy nhiệt độ 70°C là nhiệt độ ức chế hoạt tính enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh.
Kết quả trên cho thấy nhiệt độ của môi trường sống ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh.
So sánh kết quả nghiên cứu enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh có sự khác biệt với kết quả nghiên cứu lipaza trên cá măng (milkfish) của Tan et al (năm 2004) có nhiệt độ tối ƣu là 45°C - 50°C, trên cá mòi (sardine) của Gjellesvik et al (năm 1992) có nhiệt độ tối ƣu là 37°C, trên một số loại vi sinh vật nhƣ pseudomonas sp của lima et al( năm 2004 ) có nhiệt độ tối ƣu là 45 °C và penicillium camemberti của Destain et al (năm 1997) nhiệt độ tối ƣu là 48°C. Sự so sánh cho thấy thực nghiệm enzyme lipaza trong một số nội tạng cá nhƣ cá mòi (sardine), cá măng (milkfish) và lipaza thu nhận từ vi sinh vật nhƣ pseudomonas sp, penicillium camemberti có tính bền nhiệt hơn so với enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh.
Đối với một số loài cá nhƣ cá đối xám (M.A.Islam et al(2008)) và cá Cirrhinus reba (M.A.Islam et al(2009))thì nhiệt độ tối ƣu cho hoạt tính lipaza lần lƣợt là 33°C và 35°C. Nhiệt độ tối ƣu hoạt tính lipaza 2 loài cá trên gần với nhiệt độ tối ƣu hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh. Với cá tuyết (Raso and hultin, 1988) nhiệt độ tối ƣu là 25°C thấp hơn so với nhiệt độ tối ƣu của enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh. Sự so sánh cho ta thấy đƣợc đối với enzyme lipaza thu nhận từ các nguồn khác nhau sẽ có nhiệt độ tối ƣu khác nhau.
Kết Luận : xác định đƣợc enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh có nhiệt độ tối ƣu là 30°C tại nhiệt độ này enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh thể hiện hoạt tính cao nhất.
4.4.2 Xác định ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh tạng tôm hùm xanh
Ủ mẫu enzyme đã đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất tỷ lệ mẫu enzyme/ nƣớc cất : 1/ 5 (w/v), ở nhiệt độ tối thích với pH thay đổi lần lƣợt là : 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (sử dụng đệm vạn năng và điều chỉnh pH thích hợp) xác định hoạt tính lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả xác định hoạt tính đƣợc trình bày trong bảng 2.4 phụ lục 2 và đồ thị 4.4 dƣới đây:
Đồ thị 4.4 : Yếu tố pH ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh
Enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh thể hiện hoạt tính cực đại tại pH : 6.0. Yếu tố pH ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh tuân theo quy luật nhƣ sau:
Tại pH 2.0 enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh gần nhƣ mất hoạt tính HTL chỉ còn 1.25( µmol/h.ml).
Hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh tăng dần từ pH 2.0 đến pH 6.0, đạt cực đại tại pH 6.0 và giảm nhẹ từ pH 7.0 đến pH 8.0 . Hiện tƣợng này có thể giải thích mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp đảm bảo cho enzyme và cơ chất tích điện trái dấu nhau để có thể liên kết với nhau tạo nên phức hợp enzyme–cơ chất (ES). Khi đó enzyme mới có thể xúc tác mạnh sự thủy phân cơ chất.
So sánh với một số nghiên cứu lipaza khác thì pH tối ƣu hoạt động của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh thấp hơn so với lipaza tổng hợp từ chủng
Streptomyces riromus. Theo Marija Ablamic và Iwanalescie, hoạt động mạnh nhất ở pH tối ƣu là 9,5, pseudomonas sp của lima et al( năm 2004 ) hoạt động mạnh nhất ở khoảng pH từ 8.0 ÷ 9.0, một số loài cá nhƣ cá đối xám (M.A.Islam et al(2008)) cũng hoạt động mạnh nhất ở pH 8.0. Những enzyme lipaza thu nhận từ một số vi sinh vật
Streptomyces riromus, pseudomonas sp trên và loài cá đối xám, cá tuyết, cá mòi đều hoạt động mạnh trong môi trƣờng kiềm khác với enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh hoạt động tối ƣu trong pH 6.0 môi trƣờng acid yếu. Đối với một số enzyme lipaza từ loài cá nhƣ cá Cirrhinus reba (M.A.Islam et al(2009)) hoạt động tối ƣu ở khoảng pH từ 5.5 ÷ 6 thì pH tối ƣu đều ở pH acid yếu.
Kết quả trên cho thấy pH của môi trường sống ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh.
Kết Luận : xác định đƣợc enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh có pH tối ƣu là 6.0 tại nhiệt độ này enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh thể hiện hoạt tính cao nhất.
4.4.3 Xác định ảnh hƣởng của ion kim loại hoát trị II đến hoạt tính enzyme lipaza thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh thu nhận từ nội tạng tôm hùm xanh
Ủ mẫu enzyme từ nội tạng tôm hùm xanh đã đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất tỷ lệ mẫu enzyme/ nƣớc cất : 1/5 (w/v) với 1ml các ion kim loại thay đổi lần lƣợt là : Ca2+, Mg2+, Hg2+, Zn2+ và Cu2+ ở nồng độ 1mM và 5 mM, không có mặt ion kim loại ở nhiệt độ tối thích và pH tối thích. Xác định hoạt tính lipza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả xác định hoạt tính lipaza nội tạng tôm hùm xanh khi ủ với các ion kim loại hóa trị II khác nhau ở nồng độ 1mM và 5mM. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 2.5, bảng 2.6 phụ lục 2 và đồ thị 4.5, đồ thị 4.6 dƣới đây:
Đồ thị 4.5 : Yếu tố Ion kim loại hoát trị II (nồng độ 1mM )ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh
Đồ thị 4.6 : yếu tố Ion kim loại hoát trị II (nồng độ 5mM )ảnh hưởng đến hoạt tính lipaza mẫu enzyme nội tạng tôm hùm xanh
Nhận xét : từ đồ thị 4.5 và 4.6 cho thấy
Hoạt tính của enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh bị ức chế mạnh bởi các ion kim loại nặng hóa trị II (nồng độ 1mM và 5mM) nhƣ : Hg2+, Zn2+ bị ức chế hoạt động ít hơn khi có sự hiện diện diện của ion kim loại Cu2+ , Mg2+ .Điều này do nhóm SH (nhóm sulfulhydryl) trong trung tâm hoạt động của enzyme lipaza có khả năng tƣơng tác rất mạnh với các ion kim loại hóa trị II đặc biệt là ion Hg2+. Khi có sự kết hợp này chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động của enzyme. Vì vậy cơ chất sẽ không còn cơ hội để tiếp cận với trung tâm này. Nhóm Hg2+ cồng kềnh can thiệp đến không gian tại vị trí hoạt động cơ chất tiếp cận với enzyme. Kết quả là hoạt tính của enzyme sẽ giảm. Các nghiên cứu trƣớc đây đã công bố cũng chỉ ra sự làm giảm hoạt tính của enzyme lipaza của các ion kim loại hóa trị II. Hg2+ làm giảm hoạt
tính của enzyme lipaza của mô mỡ chuột (Fredrikson et al., 1981). Ion Cu2+ , Mg2+
,Hg2+ , Zn2+ ức chế hoạt động enzyme lipaza trong cá đối xám(M.A.Islam et al(2008)) Đối với enzyme lipaza nội tạng tôm hùm xanh nhìn vào đồ thị trên ta có thể thấy khi ủ ion Hg2+ nồng độ 1mM và 5mM trong 2h thì hoạt tính bị giảm mạnh chỉ còn 26.03% và 14.86% so với hoạt tính lipaza cực đại khi không có sự có mặt của ion kim loại. Với ion Zn2+ nồng độ 1mM và 5mM trong 2h thì hoạt tính lipaza giảm chỉ còn 47.95%, 24.32% so với hoạt tính lipaza cực đại. Khi ủ với Ion Cu2+ , Mg2+ thì sự giảm hoạt tính ít hơn so với Hg2+ , Zn2+.
Hoạt tính của enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh tăng nhẹ (tăng 9.59% so với hoạt tính lipaza cực đại ) khi ủ với ion Ca2+ (nồng độ 1mM ) trong 2h. Sự tăng nhẹ hoạt tính lipaza nội tạng tôm hùm xanh khi có mặt ion Ca2+ (nồng độ 1mM) có thể là do ion Ca2+ (nồng độ 1mM) làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất bù đắp lực đẩy tỉnh điện tạo ra giữa enzyme và cơ chất . Tuy nhiên khi ủ với ion Ca2+ (nồng độ 5mM) thì làm giảm hoạt tính enzyme lipaza trong nội tạng tôm hùm xanh phù hợp với kết quả báo cáo ở một số nghiên cứu khác (Shastry and Raghavendra Rao, 1971). Đối với Ion Ca2+ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định vƣợt qua nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme.
4.4.4 Xác định độ bền nhiệt của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh
Để xác định độ bền nhiệt của enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh, mẫu enzyme thô đƣợc pha loãng bằng nƣớc cất (tỷ lệ 1:5(w/v)) sẽ đƣợc ủ ở các nhiệt độ nhƣ sau : 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút. Sau đó đem tất cả các mẫu này đƣa về ủ ở nhiệt độ tối ƣu là 30°C rồi xác định hoạt tính enzyme lipaza bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 2.7 phụ lục 2 và đồ thị 4.7 dƣới đây:
Đồ thị 4.7: Sự biến thiên của hoạt tính tương đối (% so với cực đại) của lipaza khi xử lý nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau.
Nhận xét: từ đồ thị 4.7 cho thấy
Khi xử lý nhiệt enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm ở các nhiệt độ 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút rồi mới tiến hành xác định hoạt tính lipaza ở nhiệt độ tối ƣu là 30°C thì hoạt tính lipaza đều giảm tuyến tính. Mức độ giảm tùy thuộc vào nhiệt độ. Khi xử lý nhiệt ở nhiệt độ 70°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh giảm mạnh và rõ rệt chỉ còn 12.31 % so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C. Khi xử lý nhiệt ở 60°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza giảm còn 38,46% so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C. Khi xử lý nhiệt ở 50°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza giảm còn 46.15% so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C. Khi xử lý nhiệt ở 40°C trong 30 phút thì hoạt tính enzyme lipaza giảm nhẹ còn 75,38% so với hoạt tính cực đại ở nhiệt độ tối thích 30°C.
Sự giảm tuyến tính của hoạt tính lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh khi xử lý nhiệt ở các nhiệt độ 40°C, 50°C, 60°C, 70°C trong vòng 30 phút là do dƣới tác dụng của
nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣởng tới hoạt tính. Nhiệt độ có thể làm cho một số liên kết hydrogen trong mạng lƣới liên kết hydrogen tham gia vào việc giữ vững cấu trúc của enzyme bị đứt gãy. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào nhiệt độ xử lý, nhiệt độ càng cao thì mức độ ảnh hƣởng càng lớn. Đối với enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh thì khi nhiệt độ xử lý 70°C trong 30 phút thì enzyme thể hiện hoạt tính rất yếu.
Kết quả trên cho thấy enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh là một enzyme kém bền nhiệt, không thể bảo quản bình thƣờng ở nhiệt độ phòng, khi bảo quản ở nhiệt độ phòng thì hoạt tính enzyme lipaza từ nội tạng tôm hùm xanh giảm rất nhanh và