Theo các nghiên cứu lipaza có nhóm serin, histidin và axit aspastic ở trung tâm hoạt động của nó. Với các cơ chất không tan trong nƣớc, hoạt tính của lipaza đạt đƣợc cực đại chỉ khi nó đƣợc phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nƣớc. Quá trình đó đƣợc gọi là quá trình hoạt hoá phân pha:
Hình 2.5 Mô hình hoạt động của lipaza trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước.Sự thay đổi hình thể của lipaza trong quá trình hoạt động xúc tác. Mô hình này
Trong đó:
E: Lipaza hoà tan không hoạt động E*: Lipaza hoà tan dạng hoạt động Es*: Lipaza hoạt động có hấp phụ
Eis*: Lipaza không hoạt động đƣợc hấp phụ Sw: Cơ chất tan trong nƣớc
S: Cơ chất không tan trong nƣớc
E*Sw và Es*S: Phức hợp lipaza- cơ chất
Khi không có mặt nƣớc hoặc khi có nƣớc với lƣợng nhỏ, phản ứng ester hoá và phản ứng ester đƣợc ƣu tiên. Trong trƣờng hợp này, những đặc tính nhƣ tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất [Paul Woolley & Steffen B. Petersen, 1992].Các phản ứng do lipaza xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hƣớng của phản ứng phụ thuộc vào lƣợng nƣớc tham gia vào phản ứng. Lấy phản ứng thuỷ phân triacylglycerol làm minh họa, ta có:
Khi cung cấp đầy đủ nƣớc, phản ứng thủy phân xảy ra (theo chiều thuận) ngƣợc lại, trong điều kiện thiếu nƣớc, phản ứng ester hóa xảy ra và tổng hợp lại glyceride từ acid béo tự do và glycerol (theo chiều nghịch).Lipaza thủy phân triacylglycerol(TAG) theo từng bậc, tạo ra diacylglycerols (DAG), monoacylglycerols (MAG) và acid béo tự do (FFA), rồi cuối cùng thủy phân hoàn toàn tạo ra glycerol và acid béo tự do.
Do lipaza chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu - nƣớc, nên lƣợng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của lipaza. Điều này có thể khắc phục theo hƣớng tăng diện tích ở bề mặt tiếp xúc giữa hai pha bằng cách tạo thể nhũ
tƣơng dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa. Hoạt tính của lipaza có thể tăng rõ rệt khi sử dụng thể nhũ hóa dầu. Do đó, cần áp dụng phƣơng pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa.
2.3.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme lipaza[1]
Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Khi tăng hay giảm nhiệt độ thƣờng ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Thông thƣờng đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷50oC và ở nhiệt độ lớn hơn 70oC đa số enzyme bị mất hoạt tính. Nhƣ vậy nhiệt độ 70o
C gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme. Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme nếu nhiệt độ tăng 10oC thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng 1.5 ÷2 lần. Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH cơ chất.
Ảnh hƣởng của pH
Enzyme rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của pH. Mỗi enzyme chỉ hoạt động trong một vùng pH nhất định gọi là pH tối ƣu. pH tối ƣu của đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, axít yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme hoạt động trong vùng axít hay kiềm.
Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Khi enzyme lipaza kết hợp với cơ chất, sẽ tạo thành phức trung gian enzyme và cơ chất, phức này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm là các acid béo và giải phóng enzyme. Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lƣợng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn, nhanh chóng.
Chất tăng hoạt và kìm hãm
Sự hiện diện của một số các cation kim loại nhƣ Ca2+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipaza. Hoạt tính của lipaza bị bất hoạt bởiHg2+ và Sn2+, Zn2+, Mg2+ , cu2+.
2.3.5 Tình hình nghiên cứu hệ enzyme lipaza trong và ngoài nƣớc
Nghiên cứu ngoài nƣớc
Lipaza từ đối tƣợng vi sinh vật, động vật đƣợc nghiên cứu từ khá sớm và đầy đủ (Jaeger và cộng sự (1999)). Đa số lipaza của vi khuẩn là các glycoprotein, nhƣng một số lipaza ngoại bào là lipoprotein hay còn gọi là lipaza thật (EC 3.1.1.3).Trong số các vi khuẩn thì Acromobactersp., Alcaligenessp., Arthrobactersp., Pseudomonassp. và
Chromobacterium sp đã đƣợc đƣa vào sản xuất lipaza công nghiệp.Trong khoảng cuối thế kỷ 20, lipaza đƣợc ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học, dƣợc phẩm, protein đơn bào, xử lý chất thải và các chế phẩm sinh học khác. Lipaza trở thành một phần quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm hiện đại và đƣợc sử dụng rộng rãi trong quá trình chế biến nhiều loại sản phẩm. Chính vì enzyme lipaza đƣợc ứng dụng rộng rãi nên ngày càng nhiều các nghiên cứu về enzyme lipaza. Một số công trình nghiên cứu về enzyme lipaza nhƣ:
M.A. Islam et al, Tinh sạch và đặc tính sinh hóa của lipaza từ phần lƣng của Cirrhinus reba , nghiên cứu cho thấy nhiệt độ, pH tối ƣu của lipaza từ C.reba là 35°C và 5.5 . hoạt tính enzyme lipaza tăng lên khi có mặt Ca2+ và ức chế bởi các ion kim loại hóa trị 2 khác nhƣ : Hg2+, Zn2+, cu2+, Mg2+.
Nghiên cứu của M.A. Islam , N.Absar and Abdus Salam Bhuiyan, trích ly, tinh sạch và tính chất của lipaza từ cá đối. trong nghiên cứu này lipaza hoạt động tối ƣu ở pH 5.5 và nhiệt độ 30°C, pH 8.Và Nghiên cứu của J. NAYAK et al, nghiên cứu về enzyme lipaza nội tạng cá chép Labeo rohita ở ấn độ.
Ngoài ra đối với đối tƣợng vi sinh vật rất nhiều nghiên cứu về enzyme lipaza đƣợc công bố và ứng dụng nhƣ :
Abbas, A. Hiol, V. Deyris and L. Comeau. 2002, trích ly và tính chất của enzyme ngoại bảo từ Mucor sp chủng phân lập từ quả cọ (2002)
Saxena et al, tinh sạch và tính chất của enzyme lipaza từ Aspergillus carneus (2003)
Ở nƣớc ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu lipaza Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch enzyme lipaza từ các nguồn khác nhau phổ biến là từ vi sinh vật, động vật và ứng dụng của enzyme vào các lĩnh vực công nghê thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm. có thể thấy rõ qua một số công trình nghiên cứu đã công bố:
Trần Thị Bé Lan và các cộng sự, So sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipaza từ candida rugosa và porcine pancreas (tạp chí khoa học 2012), kết quả cho thấy enzyem lipaza từ candida rugosa đạt hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 40°C và pH 7, enzyme lipaza từ porcine pancreas đạt hoạt tính cao nhất cũng ở nhiệt độ 40°C và pH 8.5.
Một nghiên cứu của Lê Nguyễn Tố Quyên và các cộng sự (Trƣờng Đại học Bách khoa TPHCM), Nghiên cứu thu nhận enzyme lipaza từ nội tạng cá tra ( 2009). Kết quả cho thấy hoạt tính của lipaza nội tạng cá tra đạt hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 30°C và pH 7.
Nghiên cứu của Lê Thị Lan Hƣơng (Đại Học Quốc Gia TP HCM) Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch Lipaza từ Trichoderma SPP. kết quả cho thấy lipaza từ Trichoderma SPP đạt hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 50°C, pH 5.
2.4 PHƢƠNG PHÁP TRÍCH LY VÀ LÀM SẠCH ENZYME
2.4.1 Phƣơng pháp trích ly enzyme [7]
Enzyme là loại protein đƣợc tạo thành trong tế bào, các enzyme thƣờng không có khả năng di chuyển qua màng sinh học, do đó việc tách chúng ra khỏi tế bào là rất khó khăn để thu nhận enzyme nội bào ngƣời ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phƣơng pháp. Các phƣơng pháp phá vỡ tế bào thƣờng đƣợc sử dụng:
Phƣơng pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền nhƣ bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa, li tâm….Phƣơng pháp vật lý nhƣ dùng sóng siêu âm. Phƣơng pháp hóa học nhƣ dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate.
Có 3 khó khăn trong việc tách enzyme ra khỏi tế bào cần hết sức lƣu ý:
+ Enzyme có trong tế bào với lƣợng không lớn so với các thành phần khác.Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là rất khó khăn.
+ Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi có tác động của các yếu tố bên ngoài.
+ Enzyme là protein. Protein enzyme luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhƣng lại có tính chất lí hóa rất giống protein enzyme, do đó việc tách protein enzyme ra khỏi các loại protein gặp những khó khăn nhất định.
Sau khi phá vỡ tế bào, nƣớc, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phƣơng pháp trên. Dịch chiết thu đƣợc ngƣời ta gọi là dịch chiết enzyme thô vì trong chế phẩm này ngoài enzyme còn có nƣớc, protein không phải enzyme , các thành phần của tế bào.
Nhƣ vậy việc làm sạch enzyme chính là việc loại protein không phải là enzyme, nƣớc, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme.
2.4.2 Phƣơng pháp làm sạch enzyme [7]
Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, ngƣời ta thực hiện những phƣơng pháp sau:
2.4.2.1 Phƣơng pháp gây biến tính chọn lọc
Phƣơng pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phƣơng pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt. Ngƣời ta đƣa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70oC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó, bằng phƣơng pháp ly tâm hoặc phƣơng pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.
2.4.2.2 phƣơng pháp kết tủa phân đoạn
Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thƣờng sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, ngƣời ta đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ nhƣ etanol, acetone để kết tủa protein. Khi thực hiện kết tủa cần phải tiến hành làm lạnh chất kết tủa và cả dung dịch enzyme.
2.4.2.3 Phƣơng pháp hấp thu chọn lọc
Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ hydrocyapatite. Phƣơng pháp này có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, thƣờng thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0°C. Sau khi hấp thụ ta lại tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp.
2.4.2.4 Phƣơng pháp sắc ký
Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nƣớc và tác nhân trao đổi ion, có thể áp dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) để làm sạch enzyme. Thƣờng sử dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion sau:
+ Nhựa trao đổi ion.
+ Dẫn suất ester của cellulose nhƣ carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose.
Dựa vào đặc tính phân cực của protein : + Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography). + Sắc ký giấy.
+ Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography).
+ Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC). Dựa vào kính thƣớc protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography).
Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): sắc ký ái lực (Affinity Chromatography).
2.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME LIPAZA [13]
2.5.1 Phƣơng pháp đo độ đục
Trong môi trƣờng rắn
Phƣơng pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic đƣợc dùng làm cơ chất, bản chất là xác định đƣờng kính của vùng khuếch tán sản phẩm. Sự phân giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch. Hiện tƣợng quang học này quan sát đƣợc khi các axit béo đƣợc giải phóng ra hòa tan một phần vào nƣớc. Quá trình sáng màu này là kết quả của sự giảm kích thƣớc của các hạt nhũ bị thủy phân có tác dụng làm giảm ánh sáng khuếch tán.
Trong môi trƣờng lỏng
Phƣơng pháp này theo dõi sự giảm độ hấp phụ theo thời gian của hệ nhũ TAG, kỷ thuật này rất nhạy với hệ nhũ nhân tạo, tuy nhiên đối với hệ nhũ tự nhiên nhƣ huyết tƣơng thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác ảnh hƣởng đến kết quả. Phƣơng pháp này cho giá trị hoạt tính lipaza không chính xác, do đó phải xây dựng một đƣờng chuấn sử dụng lipaza tinh khiết.
Hình 2.6 : Cơ chế phương pháp đĩa Wilhelmy
Trong đó:
A xác định hoạt tính lipaza với cơ chất là các chuỗi chất béo mạch trung bình
B xác định hoạt tính lipaza với cơ chất là các chuỗi chất béo mạch dài với sự tham gia của β-cyclodextrin.
1. dụng cụ đựng phủ một lớp teflon . 2. màng teflon di động
3. dụng cụ đo áp suất bề mặt 4. bản mỏng bạch kim (Pt)
5. phân bố của màng film chất béo 6. ngăn phản ứng
7. ngăn chứa 8. kênh bề mặt 9. β-cyclodextrin E lipaza trong dung dịch
E* lipaza bị hấp thụ tới màng film lipid.
Trong số các phƣơng pháp xác định sức căng bề mặt thì kỷ thuật màng fiml đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc không khí- nƣớc đƣợc phát triển rộng rãi đƣợc sử dụng bởi
nhóm nghiên cứu fréderic beisson và brockman. Kỷ thuật này yêu cầu cần một dụng cụ đựng chứa đầy dung dịch nƣớc có phủ một lớp teflon (chống dính). một bản mỏng bạch kim nhúng trong bề mặt của pha nƣớc đƣợc gắn vào một dụng cụ để đo áp suất bề mặt (π) từ đó xác định sức căng bề mặt (γ ) bằng công thức :π= γo– γ với γo là giá trị tham khảo sức căng bề mặt không khí- nƣớc. Từ một dung dich chất béo trong dung môi bay hơi kém tan trong nƣớc ví dụ nhƣ chloroform thì một màng film đơn phân tử chất béo có thể phân bố trên bề mặt pha nƣớc. Dung dịch chất béo đƣợc thêm vào dạng giọt nhỏ. Khu vực lan truyền của màng film chất béo có thể đƣợc hạn chế và điều chỉnh bởi lớp teflon quét qua bề mặt của pha nƣớc. Vì vậy sức áp suất bề mặt có thể duy trì không đổi bằng cách dịch chuyển vị trí của lớp teflon. Lớp teflon đƣợc kiểm soát và điều chỉnh tùy thuộc vào kết quả xuất ra của thiết bị đo áp suất bề mặt. Nếu dịch chiết enzyme lipaza đƣợc đƣa vào pha nƣớc dƣới màng film chất béo thì áp suất bề mặt sẽ giảm do sản phẩm của phản ứng lipolytic. Khi mà lớp teflon di chuyển để duy trì áp suất bề mặt không đổi thì động học của phản ứng sẽ đƣợc theo dõi bằng cách ghi lại sự di chuyển của lớp teflon theo thời gian.
Màng film đơn phân tử tạo các sản phẩm hòa tan trong nƣớc trong quá trình phản ứng. Phƣơng pháp này phù hợp cho việc nghiên cứu phản ứng enzyme trên chất béo mà đƣợc phân bố tại bề mặt tiếp xúc không khí-nƣớc, phƣơng pháp này có độ nhạy cao, lƣợng chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy.
2.5.3 Phƣơng pháp hiển vi lực nguyên tử
Để theo dõi động học sự thủy phân của màng phospholipid kép bằng phospholipaza A2, Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phƣơng pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM) trong môi trƣờng chất lỏng.
2.5.4 Phƣơng pháp quang phổ học hồng ngoại
Phƣơng pháp này đo sự thủy phân của những TAG do lipaza xúc tác trong hệ micell đảo ngƣợc dựa trên dự thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR ) đƣợc phát triển bởi walde và luisi. Sự phân giải chất béo đƣợc theo dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của toàn bộ hỗn hợp phản ứng. ester của acid béo và acid béo tự do đƣợc định lƣợng dựa trên hệ số tắt và định luật beer. Phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng để đo sự phân hủy chất béo của những cơ chất khác nhau (các loại dầu thực vật…).
2.5.5 Phƣơng pháp dùng chất chỉ thị màu
Trong môi trƣờng lỏng đây là một phƣơng pháp định tính, kỷ thuật đơn giản để xác định hoạt tính lipaza bằng việc quan sát sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị màu đƣợc trộn đều với cơ chất là các ester khi có mặt lipaza.
2.5.6 Phƣơng pháp chuẩn độ
Đây là phƣơng pháp định lƣợng đơn giản thích hợp cho việc xác định hoạt tính