VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.1.5.Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi từ callus
Các callus đã được biến nạp, sau 3 - 4 tuần nuôi cấy trên môi trường N3 được chuyển sang môi trường tái sinh (TS). Ở giai đoạn này callus được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/24 giờ/ngày đêm với cường độ 2000 lux để tăng khả năng phân hoá của callus. Sau 2 tuần ở một số callus bắt đầu xuất hiện những chồi xanh nhỏ, sang tuần thứ 3 – 5 các chồi xanh xuất hiện nhiều
hơn và tỉ lệ tái sinh cuối cùng đạt được khoảng 52% do ảnh hưởng ức chế của chất kháng sinh cefotaxime trong quá trình rửa loại bỏ vi khuẩn A. tumefaciens. Những callus không bật thành chồi thì nó có màu đen và bị chết. Sau khi tiến hành quan sát cụ thể chúng tôi xác định được rằng: Những callus không bị nhiễm và tế bào của callus đang phân chia mạnh trên môi trường N3 kích thước đạt từ 3 - 5 mm trở lên có màu vàng sáng khô và xốp mới có khả năng tái sinh, những callus này là kết quả của quá trình phân hoá tốt nhất nên khi chuyển sang môi trường mới chúng được cảm ứng để hình thành chồi. Còn các dạng callus khác (màu trắng đục, màu vàng nhạt, màu đen, nhày- nhớt- ướt) thường không có khả năng tái sinh chồi hoặc tái sinh chồi kém. Nếu chồi mọc từ những callus này thì rất nhanh bị vàng. Kết quả nghiên cứu phù hợp với một số nghiên cứu trên các đối tượng khác như ở cam (Hà Thị Thúy và cộng sự) và ngô (Phạm Thị Lý Thu và cộng sự, 2003). Do vậy, khi cấy chuyển sang môi trường mới ta nên lựa chọn các loại callus có các đặc điểm trên để cấy. Tuy nhiên việc cấy chuyển callus chỉ nên thực hiện ít lần, vì nếu cấy chuyển nhiều thì khả năng tái sinh của callus bị giảm đi.
Hình 3.11: Dạng hình dạng hình thái callus không hoặc ít có khả năng tái sinh chồi
Để nghiên cứu xác định môi trường thích hợp tái sinh chồi chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BAP lên sự tái sinh chồi từ callus của hai giống lúa trong quá trình nuôi cấy. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Cấy chuyển callus sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA và BAP ở các nồng độ khác nhau. Các nồng độ sử dụng trong nghiên cứu 1,5mg/l, 2,0mg/l, 2,5mg/l, 3,0mg/l được ký hiệu từ TS1 đến TS4. Sau 6 – 8 tuần nuôi cấy tiến hành theo dõi, kiểm tra và đánh giá kết quả được trình bày ở (bảng 3.9)
Bảng 3.9: Kết quả tái sinh chồi từ callus trên các môi trường khác nhau (sau 8 tuần theo dõi)
Giống Môi trường
Σ số mẫu
Khả năng tạo chồi mẫu tạo
chồi
Tỉ lệ (%)
T22
TS1 120 18 15,0 chồi yếu là xanh nhạt phát triển chậm
TS2 120 33 27,5 chối phát triển TB lá xanh
TS3 120 59 49,2 chồi khoẻ lá xanh
phát triển nhanh
TS4 120 38 31,6 chối phát triển TB lá xanh
KDĐB
TS1 120 28 23,3 chồi yếu là xanh nhạt phát triển chậm
TS2 120 67 55,8 chồi khoẻ lá xanh
phát triển nhanh
TS3 120 45 37,5 chồi phát triển TB lá xanh
TS4 120 42 35,0 chồi phát triển TB láxanh
Qua bảng cho thấy ở môi trường có nồng độ BAP 1,5mg/l đều cho hệ số nhân chồi thấp hơn và ở giống KDĐB nếu tăng nồng độ BAP lên từ 2,5 - 3,0 mg/l thì hệ số nhân chồi lại giảm xuống. Vì vậy có thể kết luận môi trường TS2 thích hợp cho việc nhân chồi giống KDĐB
Đối với giống DT22 thì sự tái sinh chồi tỉ lệ thuận với nồng độ BAP. Nếu xét chung môi trường TS1, tỉ lệ tái sinh chồi thấp hơn ở môi trường TS2 và TS3, do nồng độ BAP 1,5 mg/l chưa phải là nồng độ tối ưu để tái sinh chồi.
Thời gian xuất hiện điểm xanh và thời gian hình thành chồi có chiều cao 0,5 cm ít có sự chênh lệch ở cả 2 giống. Tuy nhiên nếu xét đến độ cứng cáp và màu sắc chồi được tái sinh thì có sự khác nhau. Cụ thể:
Giống DT22 chồi có màu xanh đậm, trong môi trường TS3, sau khi cấy 5 tuần xuất hiện các điểm xanh và sau khoảng 8 tuần xuất hiện chồi và các cụm chồi, tuy nhiên số lượng chồi không nhiều.
Giống KDĐB chồi có màu xanh đậm, độ cứng cây cao hơn trong môi trường TS2, có ít cây bạch tạng. Sau khoảng 4 tuần thấy xuất hiện điểm xanh, sau khoảng 7 tuần thì từ các điểm xanh đó hình thành chồi và các cụm chồi tạo ra rất nhiều, như vây giống này có khă năng tái sinh và phân hoá chồi rất cao.
Từ những kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng môi trường TS2 là môi trường tái sinh chồi phù hợp cho giống KDĐB. Môi trường TS3 là môi trường tái sinh chồi phù hợp cho giống DT22.
Hình 3.12: Các callus trên môi trường tái sinh thích hợp sau 3 tuần nuôi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.13: Các callus trên môi trường tái sinh thích hợp sau 8 tuần nuôi cấy