VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.1.2.Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp để tạo callus
Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể sử dụng để nuôi cấy, tuy nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào ba yếu tố chủ yếu: loại thực vật, hệ thống môi trường nuôi cấy và sự khử trùng mẫu cấy thành công. Thành phần môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định đến sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật [12], [15], [20], [22].
Hạt lúa được bóc vỏ trấu và khử trùng theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.2.1. Sau 2 tuần nuôi cấy hạt trên các đĩa Petri có chứa môi trường tạo callus (T), đánh giá tỉ lệ phần trăm callus được tạo ra ở các môi trường khác nhau. Môi trường thích hợp là môi trường có tỉ lệ callus tạo ra nhiều, chất lượng callus tốt (callus có màu trắng sáng), kết quả thí nghiệm được thể hiện trong (bảng 3.7)
Bảng 3.7: Kết quả tạo callus từ mô phôi trưởng thành trên các môi trường (T) Giống Σ số mẫu cấy/1 môi trường (mẫu)
Tỉ lệ mẫu tạo callus trên các môi trường Môi trường (T1) Môi trường T2 Môi trường T3
Số mẫu tạo Callus (mẫu) Tỉ lệ tạo callus (%) Số mẫu tạo Callus (mẫu) Tỉ lệ tạo callus (%) Số mẫu tạo Callus (mẫu) Tỉ lệ tạo callus (%) DT22 500 469 93,35 367 73,42 326 65,32 KDĐB 500 413 82,50 268 53,34 233 46,67
Hình 3.3: Biểu đồ tỉ lệ tạo callus trên các môi trường T khac nhau
có callus phát triển nhanh hơn, màu vàng sáng hay vàng đậm kích thước callus tương đối đồng đều. Tỉ lệ tạo callus của hai giống đều cao (từ 82,50 – 93,35), sau 2 tuần không thấy bị đen. Ở môi trường T2 callus được tạo ra thường có màu trắng ngà, kích thước callus nhỏ không đồng đều chồi mầm phát triển mạnh. Môi trường T3 tỉ lệ callus tạo ra thấp hơn môi trường T1 và T2 chỉ đạt từ 46,67 - 65,32%, callus có màu vàng đậm kích thước callus không đều và có hiện tượng bị đen khi kéo dài thời gian nuôi cấy chồi mầm bị ức chế mạnh.
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành callus. 2,4-D là auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm phân tử của nó nên các enzyme oxy hoá auxin (auxinoxidase) không có tác dụng phân huỷ. Auxin 2,4-D có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp thường được sử dụng với hàm lượng từ 0,1 – 2,0 mg/l. khi sủ dụng với nồng độ cao mô sẽ bị nhiễm độc. Có thể được giải thích hiện tượng này bởi trong môi trường T1 có chứa 2,0 mg/l 2,4-D là nồng độ tối thích cho sự hình thành callus của hai giống lúa trên. Trong môi trường T3 tăng nồng độ 2,4-D lên 3,0 mg/l nên các mẫu đã có hiện tượng ức chế sự phát triển của chồi và hình thành callus. Do vây, các callus được hình thành sẽ nhiễm độc và ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mô sau biến nạp. Cũng có thể ở các giống nghiên cứu có hàm lượng auxin tự nhiên. Ở môi trường T2, tỷ lệ phần trăm callus tạo ra nhiều có màu trắng ngà kích thước nhỏ, không đều chồi mần phát triển mạnh và chất lượng callus không tốt là do ảnh hưởng của cytokinin. BAP là cytokinin hoạt lực cao có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ và sự sinh trưởng của callus. Mặt khác do ảnh hưởng của BAP một số tế bào của callus đã được kích thích tái sinh sớm nên ảnh hưởng đến kết quả chuyển gen
Như vậy, môi trường T1 là môi trường tạo callus thích hợp cho cả 2 giống lúa nghiên cứu. Sau đây là một số hình ảnh callus được ghi lại trong quá trình nuôi cấy hạt lúa trên các loại môi trường
Hình 3.4: Tạo callus trên môi trường T1
1. Giống lúa KDĐB 2. Giống lúa DT22
Hình 3.5: Tạo callus trên môi trường T3
3. Giống lúa KDĐB 4. Giống lúa DT22
1 2
Hình 3.6: Tạo callus trên môi trường T2
5. Giống lúa KDĐB 6. Giống lúa DT22