VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
2.2.1.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α bằng kỹ thuật sốc nhiệt (heat shock)
nhiệt (heat shock)
Hiệu quả biến nạp phụ thuộc vào tế bào chủ, kích thước vectơ tái tổ hợp và kỹ thuật biến nạp thích hợp. Để hiệu quả biến nạp cao, cần lựa chọn kỹ thuật biến nạp thích hợp với mỗi loại tế bào chủ. Khi tế bào chủ là vi khuẩn thường sử dụng phương pháp biến nạp bằng kỹ thuật sốc nhiệt là có hiệu quả cao, dễ thực hiện...
a. Chuẩn bị tế bào khả biến
Tế bào chủ là vi khuẩn E.coli thuộc chủng DH5α được nuôi cấy trên môi trường LB. Nuôi cấy một khuẩn lạc E.coli vào 5ml môi trường LB lỏng, ở 370C, lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 12 - 16 giờ. Sau đó lấy 1ml dịch
vi khuẩn với 99 ml môi trường LB nuôi lắc 2 - 3 giờ. Giữ dịch nuôi cấy trên đá trong 1,0 - 1,5 giờ, li tâm thu tủa tế bào ở 40C với tốc độ 4500 - 5000 vòng/phút trong 8 – 10 phút.
Hoà tủa tế bào trong 100ml CaCl2 100mM lạnh, để trên khay đá 15 phút rồi li tâm lạnh thu tủa tế bào. Tủa tế bào được hòa trong 40ml CaCl2
100mM lạnh, để 1 giờ trên đá, sau đó li tâm thu tủa tế bào với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút, thêm 500μl CaCl2 100mM lạnh, có chứa 15% glycerol vào tủa tế bào thu được các tế bào khả biến. Chia đều vào mỗi ống eppendorf 50μl tế bào khả biến, giữ trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -750C đến -800C để thực hiện biến nạp.
b. Biến nạp plasmid vào E.coli DH5α
Trong nghiên cứu này, plasmid được biến nạp vào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Trong quá trình sốc nhiệt, dưới tác dụng của nhiệt độ cao, màng tế bào E.coli trở nên xốp tạo ra các khe hở cho plasmid có thể chui vào, sau đó nhiệt độ bị hạ thấp đột ngột làm cho các khe hở này khép lại, đẩy plasmid vào trong tế bào.
* Qui trình biến nạp như sau :
Lấy 50μl tế bào khả biến đang giữ trong ống eppendorf ở nhiệt độ -750C đến -800C (trong tủ lạnh sâu) để trên đá khoảng 15 phút, thêm 0,5ng DNA plasmid đảo nhẹ ống 3 - 4 lần và để trên đá khoảng 15 – 20 phút.
Đặt mẫu vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 420C trong 2 phút, khi kết thúc đặt nhanh lên đá trong 2 phút. Sau đó thêm khoảng 1000μl môi trường LB lạnh, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 370C trong 30 – 60 phút. Lấy 100μl dịch tế bào đã sốc nhiệt trải đều trên đĩa petri môi trường LB 2% agarose có bổ sung 50mg/l kanamicin. Nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ, kiểm tra các khuẩn lạc phát triển trên đĩa petri. Thu nhận khuẩn lạc, cấy vào môi trường LB lỏng để kiểm tra kết quả.
Biến nạp E.coli bằng kỹ thuật sốc nhiệt có hiệu quả khoảng 1/10000. Chọn lọc các tế bào mang vectơ tái tổ hợp, chuyển sang đĩa petri thạch
* Lưu giữ các tế bào được biến nạp
Sau khi quá trình biến nạp được hoàn tất, ta thu được từng khuẩn lạc đơn cho nuôi cấy lắc trong môi trường LB qua đêm ở 370C, sau đó lưu giữ chúng trong glyceron 25% ở -200C. Phương pháp này cho phép có thể lưu giữ lâu dài các tế bào đã được biến nạp.
c. Tách chiết DNA plasmid từ E.coli
Chuẩn bị dịch nuôi cấy vi khuẩn thích hợp, sử dụng môi trường LB có bổ sung kháng sinh 50mg/l kanamycin để vi khuẩn có số lượng plasmid cao nhất. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút qua đêm, li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 - 6 phút thu sinh khối (cặn tế bào).
Tế bào thu được ở mỗi ống nghiệm đem hoà tan trong 200µl dung dịch I: (100 mM Tris HCl, 10mM EDTA, 40.000 µg RNase I pH = 8.0). EDTA (Ethylendiamine tetracetic acid) hấp thụ các ion Mg++ làm vỡ thành tế bào, đồng thời ức chế các enzym phân hủy DNA. Sau đó xử lí natri acetat (pH = 4,3) và li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Sau li tâm, DNA bộ gen và protein kết tủa ở đáy ống, lớp dịch nổi phía trên chứa DNA plasmid. Thu lớp dịch nổi chứa plasmid chuyển sang ống khác, thêm ethanol 100% (hoặc izopropanol) lạnh để kết tủa DNA plasmid.
Li tâm 14000 vòng/phút trong 10 - 15 phút, thu tủa DNA plasmid hòa trong nước khử ion hoặc dung dịch TE, sau đó kiểm tra đôi tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1%.