VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.1.1.Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch đưa vào
nuôi cấy
Khử trùng mẫu là công đoạn đầu tiên có ý nghĩa quyết định đến kết quả của quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đây là kỹ thuật tạo nguồn nguyên liệu sạch phục vụ cho công tác nghiên cứu tuyển chọn và tạo các giống mới. Những khâu quan trọng của kỹ thuật vô trùng là khử trùng mẫu cấy, khử trùng môi trường nuôi cấy, duy trì trạng thái vô trùng trong suốt quá trình nuôi cấy [3], [12], [26].
Vi khuẩn và nấm là hai nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy mô thực vật. Bào tử nấm rất nhỏ nhẹ và hiện diện khắp nơi trong môi trường sống. Khi bào tử nấm tiếp xúc với môi trường nuôi cấy sẽ nảy mầm và nhanh chóng phát triển thành nguồn gây nhiễm [12].
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu thực vật để nuôi cấy không thể khử trùng bằng nhiệt độ cao, mà phải khử trùng để cho mẫu vô trùng nhưng vẫn đảm bảo được bản chất sinh học của mẫu. Do vậy, các mẫu cấy (mô, cơ quan) thực vật phải được khử trùng bằng các hóa chất. Hypoclorit canxi – Ca(ClO)2, hypoclorit natri – NaClO, thủy ngân clorua (HgCl2), oxy già (H2O2)…là những hoá chất thường dùng trong khử trùng mẫu mô thực vật. Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại hóa chất sử dụng, thời gian và nồng độ của các hóa chất khử trùng. Các hóa chất dùng để khử trùng phải tiêu diệt hoàn toàn các tác nhân gây nhiễm nhưng vẫn duy trì sức sống của các mẫu nuôi cấy [12], [37].
Nghiên cứu để tìm ra quy trình khử trùng thích hợp cho hai giống lúa có ý nghĩa quyết định thành công của đề tài. Với mục đích trên, những hạt lúa tốt đã được chọn để bóc vỏ trấu và khử trùng như mô tả ở mục 2.2.2.1
Hạt đã khử trùng được cấy vào các đĩa Petri có chứa môi trường tạo callus (T), với mật độ 25 hạt/đĩa. Đĩa nuôi callus được đặt trong tối sau 7 – 10 ngày, callus có kích thước khoảng 3mm được đặt dưới ánh sáng neon với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, độ ẩm từ 65 - 75%, nhiệt độ phòng nuôi 250C. Sau 2 tuần cấy theo dõi và thu thập số liệu