VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.2.2.Kết quả phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của gen chitinase
PCR là kỹ thuật chính được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng trong nghiên cứu phát hiện trình tự DNA đã được đưa vào các cơ thể nhận với cặp mồi đặc trưng. Quy trình đầu tiên dựa trên cơ sở PCR đã được đề xuất bởi Carrari và Hopp (1998). Từ đó đã có rất nhiều cặp mồi khác nhau để khuyếch đại trình tự DNA có mặt trong hầu hết các cơ thể biến đổi gen chẳng hạn như đoạn promoter CaMv 35S của Cauliflower mosaic virus và đoạn terminator
NOS của Ti-plasmid từ vi khuẩn Agrobacteriun. Đây là trình tự quan trọng đối với sự biểu hiện của các gen ngoại lai trong thực vật. Trong đó đoạn
1 2 3 4 5 6 7 8 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
promoter 35S là trình tự có mặt trong hầu hết các cây trồng biến đổi gen đang được thương mại hoá. Vì vậy, việc phát hiện được thành phần này sẽ giúp ta chuẩn đoán được đa số các cơ thể có chứa gen ngoại lai.
Có rất nhiều cặp mồi đã được thiết kế để nhận biết đoạn promoter 35S như: 5S-afl/35S-arl, HA-35S 118f/HA-35S118r, 35S-cf3/35S-cr4, 35S1/35S2 và CM01/CM02 để nhận biết đoạn promoter 35S trong các mẫu thí nghiệm. Cặp mồi CM01/CM02 khuyếch đại trình tự DNA đặc trưng của đoạn
promoter CaMV-35S có kích thước 220bp.
Sau khi kiểm tra nồng độ DNA chúng tôi tiến hành pha loãng các mẫu DNA có nồng độ cao để đạt hàm lượng cuối cùng là 30ng/μl, đây là nồng độ thích hợp để tiến hành phản ứng PCR. Phản ứng PCR được chạy theo chu trình nhiệt độ sau:
Đầu tiên là giai đoạn biến tính ban đầu (ở 940C trong 5 phút) để sợi DNA kép tách thành hai sợi đơn.
Tiếp đến chạy 40 chu kỳ lặp lại, với các giai đoạn biến tính, đính mồi và kéo dài chuỗi. Ở nhiệt độ 580C trong thời gian 30 giây hai đoạn mồi (sense và antisense) sẽ bắt cặp với hai sợi đơn DNA khuôn. Và ở 720C (trong 30 giây) sẽ là giai đoạn tổng hợp nhờ xúc tác của enzym Taq polymerase. Tiếp đến là kéo dài chuỗi 720C trong 6 phut để giúp các đoạn DNA tổng hợp nốt tạo nên một mạch DNA bổ sung hoàn chỉnh.
Mẫu đối chứng dương sử dụng plasmid RCC2 làm khuôn tổng hợp DNA. Mẫu đối chứng dương sử dụng để kiểm tra chu trình nhiệt, đảm bảo chu trình là tối ưu cho cặp mồi trên. Mẫu đối chứng âm là mẫu DNA tách chiết từ lá của hai giống lúa nghiên cứu nuôi cấy in vitro không qua biến nạp.
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi CM01/CM02, điện di sản phẩm trên gel agarose 1% với đệm TAE1X, trong thời gian 1 giờ 30 phút, ở cường độ 90mA, 120mA, 150mA (cứ 30 phút lại tăng dần cường độ dòng điện lên). Sử dụng thang chuẩn DNA 100bp để so sánh sản phẩm PCR và kết quả được đánh giá nhờ quan sát trực tiếp trên máy UV, Kết quả điện di (Hình 3.16, 3.17)
Hình 3.16: Kết quả điện sản phẩm PCR của lúa DT22
Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: Cây lúa lúa chuyển gen Giếng 14: Cây chưa chuyển gen (Mẫu đối chứng âm tính)
Giếng 15:Mẫu ngô chuyển gen (đối chứng dương tính)
Giếng 16: Mẫu DNA của plasmid RCC2 (mẫu đối chứng dương tính) giếng 17: Marker 100bp
Hình 3.17: Kết quả điện sản phẩm PCR của lúa KDĐB
Giếng: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: Cây lúa chuyển gen Giếng 14: Cây chưa chuyển gen (Mẫu đối chứng âm tính)
Giếng 15:Mẫu ngô chuyển gen (đối chứng dương tính)
Giếng 16: Mẫu DNA của plasmid RCC2 (mẫu đối chứng dương tính) Giếng 17: Marker 100bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 200bp 220 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 220 bp 200bp
Kết quả điện di sau khi chạy PCR với cặp mồi CM01/CM02. Cho thấy 24/26 giếng mẫu DNA tách chiết từ những chồi tái sinh cho tín hiệu khuếch đại tại vị trí khoảng 220bp so với thang chuẩn (hình 3.16, 3.17). Ở giống lúa DT22 (giếng 10, 11), có hiện tượng “escape” xảy ra trên chồi chuyển gen và ở giống KDĐB là (giếng 3, 9). Mẫu đối chứng âm là mẫu DNA tách chiết từ lá non lúa chưa chuyển gen (giếng 14) và mẫu đối chứng dương là mẫu ngô chuyển gen và plasmid (giếng15, 16). Mẫu đối chứng sau khi chạy điện di điều chứng tỏ phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm và cặp mồi sử dụng đặc hiệu cho việc kiểm tra cây chuyển gen ở hai giống lúa. Như vây, Kết quả này có thể chứng minh rằng promoter CaMV 35S cùng với cấu trúc của gen chitinase, và gen hpt đã có mặt trong cây lúa chuyển gen. Kết quả biến nạp và tái sinh cây chuyển gen ở giống lúa DT22 đạt tỉ lệ 0,16% thấp hơn giống lúa KDĐB (0,21%) và thấp hơn so với các công trình nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên lúa và những đối tượng cây trồng khác.