VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
2.2.2.1.Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch đưa vào nuôi cấy
2.2.2.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch đưa vào nuôi cấy nuôi cấy
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần 12 đĩa Petri, mỗi đĩa cấy 25 hạt.
Khử trùng mẫu cấy trước khi đưa mẫu vào môi trường là một công việc có tính chất quyết định đến sự thành công của thí nghiệm, bởi công đoạn này cung cấp mẫu sạch cho công tác nghiên cứu. Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy thực vật, nhưng một loại hóa chất được lựa chọn để khử trùng mẫu cấy phải đảm bảo hai yếu tố sau: thứ nhất là có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt, thứ hai là mức độ độc thấp đối với mô thực vật
Dựa vào tính chất hóa học của chất khử trùng và điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 2 loại hóa chất là:
- Hypoclorit natri (NaClO) ở các mức nồng độ khác nhau trong khoảng thời gian khử trùng 25 phút (lần 1 là 10 phút, lần 2 là 15 phút) để khử trùng mẫu cấy, NaClO là loại hóa chất có mức độc tính thấp với mẫu, ít có biểu hiện ức chế sinh trưởng.
- Thủy ngân clorua (HgCl2) ở nồng độ 0,1% với các khoảng thời gian khác nhau từ 6, 8 và 10 phút [30], [34], [36]. HgCl2 có khả năng thấm sâu,
tiêu diệt nấm và vi sinh vật nội nhiễm tốt hơn [12], [39]. Phương pháp tiến hành khử trùng như sau:
Chọn những hạt lúa tốt, rửa bằng xà phòng dưới vòi nước chảy để loại bớt các vi sinh vật trên bề mặt hạt, để khô và bóc vỏ trấu tránh không làm mất phôi hay tổn thương phôi. Cho các hạt vào bình tam giác và tiến hành khử trùng trong box cấy vô trùng.
Đầu tiên rửa hạt bằng nước cất vô trùng. Sau đó khử trùng bề mặt của hạt bằng cồn 70% trong vòng 30 giây và rửa sạch bằng nước cất vô trùng từ 3 - 5 lần. Tiếp theo khử trùng bằng Javen (NaClO) ở nồng độ thí nghiệm là 10%, 15% và 20% trong khoảng thời gian lần 1 là 10 phút, lần 2 là 15 phút hoặc HgCl2 0,1% với thời gian 6, 8, 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 8 - 10 lần. Việc rửa lại bằng nước cất vô trùng có tác dụng tẩy hóa chất ở giai đoạn trước, lần tiếp theo ngâm mẫu trong nước cất vô trùng 30 - 60 phút khi khử trùng bằng NaClO, 60 - 120 phút khi khử trùng bằng HgCl2.. Dùng que cấy vô trùng lấy hạt để vào giấy thấm vô trùng, chờ hạt khô và cấy vào môi trường tạo callus.
* Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất khử trùng và thời gian khử trùng thích hợp với 2 giống lúa
- Mục đích: chọn hóa chất và thời gian thích hợp đối với 2 giống đang nghiên cứu.
Bảng 2.1: Công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1%
Công thức Nồng độ (%) thời gian (phút)
1 HgCl2 0,1 6
2 HgCl2 0,1 8
3 HgCl2 0,1 10
Công thức Nồng độ (%) thời gian (phút)
1 NaOCl 10 trong 2 lần: lân1 10’ và lần2 15’
2 NaOCl 15 trong 2 lần: lân1 10’ và lần2 15’
3 NaOCl 20 trong 2 lần: lân1 10’ và lần2 15’