VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.1.4.Kết quả chuyển gen vào callus
Theo một số nghiên cứu thì việc biến nạp gen được thực hiện khi tế bào thực vật đang phân chia mạnh và có sự tổ hợp DNA trong tế bào (An, 1985). Mặt khác, sự dung hợp DNA ngoại lai phụ thuộc vào dạng tế bào thực vật và điều kiện nuôi cấy thích hợp của chúng (Vanlijse bettens, 1986). Trong nghiên cứu này callus của lúa từ 10 - 15 ngày là thích hợp cho việc chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Dựa vào bản chất tự nhiên của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
chỉ nhiễm vào các tế bào bị thương đang phân chia mạnh, do các tế bào này tiết ra các hợp chất có nguồn gốc phenol như acetosyringone (là một chất dẫn dụ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) cần thiết cho quá trình xâm nhập T- DNA của Agrobacterium tumefaciens vào tế bào. Do đó, trước khi lây nhiễm với vi khuẩn, phải gây vết thương cho callus và khi lây nhiễm phải bổ sung thêm acetosyringone để kích thích hình thành khối u. Các callus được cắt bỏ viền đen và gây vết thương trước khi sử dụng làm nguyện liệu biến nạp để tăng khả năng tiếp xúc giữ chúng và tế bào vi khuẩn. Các callus đặt vào ống ependonf chứa dung dịch vi khuẩn có bổ sung 250µM acetosyringone, lắc nhẹ 15 - 30 phút. Sau đó mẫu được lấy ra cho lên giấy thấm khô và đặt vào
môi trường N3 có bổ sung 250μM acetosyringone. Thời gian đồng nuôi cấy là 48 – 72 giờ ở nhiệt độ 280C. Đây là môi trường làm cho tế bào có khả năng phân chia mạnh, thành tế bào mỏng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập của vi khuẩn và nhiệt độ 28oC cũng là nhiệt độ tối ưu cho quá trình này.
Khả năng chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc khá nhiều vào đối tượng cây trồng, nguồn mẫu lây nhiễm. Một số cây trong quá trình sinh trưởng đã sản sinh ra phytoxic là chất có khả năng ức chế sinh trưởng rất mạnh đối với vi khuẩn [Hoshi và cs, 2004]. Khi được đồng nuôi cấy với callus lúa, sự sinh trưởng của vi khuẩn A. tumefaciens là khá mạnh và không phụ thuộc vào phương pháp lây nhiễm. Rõ ràng, trên đối tượng này, vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng sinh tưởng và phát triển. Đây là một thuận lợi cho quá trình lây nhiễm nhưng lại là khó khăn ở giai đoạn kế tiếp. Thông thường, nếu vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh trong quá trình đồng nuôi cấy, quá trình phục hồi cũng như chọn lọc sau này sẽ rất khó khăn để loại bỏ được chính vi khuẩn này.
Trong quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, việc bổ sung kháng sinh khi tiến hành diệt vi khuẩn A. tumefaciens có thể ảnh hưởng đến khả năng tái sinh [Purnima, Kothari, 2004], [Nagaraju, Sita, 1998], [Hoshi và cs, 2004]. Bên cạnh đó, cũng cần xác định được ngưỡng có tác dụng gây chết 100% của chất chọn lọc để làm cơ sở cho chọn lọc. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành xác định ảnh hưởng của các yếu tố trên đến khả năng tái sinh chồi từ callus của hai giống lúa nghiên cứu. Sự ảnh hưởng của chất kháng sinh cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh chồi của callus lúa được thể hiện khi bổ sung kháng sinh cefotaxime từ nồng độ 300 đến 700mg/l vẫn cho tỉ lệ sống của callus đạt 100% trên tất cả các công thức. Điều đó cho thấy callus có khả năng sống rất mạnh mặc dù đã bị ức chế bởi kháng sinh cefotaxime. Kháng sinh cefotaxime đã ức chế sự sinh trưởng của các chồi tái sinh và rõ
ràng là đã ảnh hưởng tới chất lượng của chồi tái sinh. Điều này được thể hiện rõ qua các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển như: chiều cao chồi tái sinh đã giảm từ 3,20cm (công thức không bổ sung cefotaxime) xuống còn 1,86cm (công thức bổ sung cefotaxime 600 mg/l); số lá giảm từ 3,5 (công thức không bổ sung) xuống 1,3 lá/chồi (công thức bổ sung cefotaxime 600 mg/l), bên cạnh đó chồi tái sinh nhỏ, thấp, màu xanh nhạt hơi vàng (bảng 3.8).
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh của callus 2 giống lúa DT22 và KDĐB (theo dõi sau 6 tuần)
CT Cefotaxime (mg/l) Tỉ lệ mẫu Sống (%) Các chỉ tiêu theo dõi
Tăng trưởng của
chồi tai sinh Hình thái của mẫu cấy và chồi tái sinh tạo callus (%) tạo rễ (%) tạo chồi (%) Chiều cao chồi (cm) số lá/chồi (lá) CT 1 0 100 100 0 100 3,20 3,5 +++ CT 2 300 100 100 0 76,5 2,90 2,3 +++ CT 3 400 100 100 0 59,6 2,75 2,0 ++ CT 4 500 100 100 0 29,2 2,33 1,8 ++ CT 5 600 100 100 0 12,3 1,86 1,3 + CT 6 700 100 100 0 0
+++: mẫu cấy (callus) có màu xanh, chồi tái sinh sinh trưởng tốt, màu xanh hình thái bình thường.
++: Mẫu cấy (callus) có màu hơi vàng, chồi tái sinh sinh trưởng chậm, chồi nhỏ, lá có màu xanh hơi nhạt.
+: Mẫu cấy (callus) màu vàng, chồi tái sinh sinh trưởng kém, chồi nhỏ, thấp, màu xanh vàng.
Như vậy, đối với nguồn mẫu cấy là callus của giống lúa DT22 và KDĐB, có thể sử dụng kháng sinh cefotaxime ở nồng độ từ 300 - 500mg/l để diệt vi khuẩn A.tumefaciens.
Sau 48 – 72 giờ trên môi trường N3 callus được lấy ra rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng có bổ sung 500mg/l carbenicilin + 350mg/l claforan (kháng sinh này có tác dụng ức chế các tế bào vi khuẩn sinh sôi trở lại), thấm khô bằng giấy thấm khử trùng đặt các callus lên môi trường N3 có bổ sung 500mg/l carbenicilin + 350mg/l claforan, tiếp tục theo dõi trong 1 tuần, nếu có callus nào bị nhiễm khuẩn trở lại sẽ được rửa lại, tuy nhiên công đoạn này phải hạn chế đến mức tối đa vì nó ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi của callus ở giai đoạn tiếp theo. Những callus không bị nhiễm chuyển sang môi trường N3 không có kháng sinh tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần tuần nữa, tạo điều kiện cho những tế bào đã được biến nạp phân chia và nhân lên với số lượng lớn sau đó chuyển sang môi trường tái sinh giúp cho callus tái sinh tốt hơn. Mẫu biến nạp sau khi loại sạch vi khuẩn và đặt ngay trên môi trường tái sinh có chứa hygromicin, mẫu thí nghiệm sẽ chết phù hợp với công bố của Milliam 1994. Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy chuyển các callus đã đươc biến nạp sang môi trường tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen. `