VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
2.2.2.3.Nghiên cứu xác định môi trường nhân nhanh callus thích hợp
* Mục đích: tạo ra một lượng lớn callus có kích thước phù hợp chuẩn bị cho biến nạp
* Cách tiến hành: Sau khoảng 10 – 14 ngay nuôi cấy trong môi trường T, tiến hành quan sát và tách callus khỏi hạt gạo. Cần chú ý trong quá trình tách ta chỉ tách lấy callus không lấy phần rễ và mầm lúa được tạo ra trong quá trình nuôi cấy tạo callus phát sinh. Tiến hành phân loại hình thái callus
theo các chỉ tiêu như màu sắc, độ lớn của callus... sau đó cấy các loại hình thái callus khác nhau vào đĩa Petri khác nhau có chứa môi trường nhân nhanh callus (N). Sau 10 - 14 ngày, kiểm tra và đánh giá.
2.2.2.4. Qui trình chuyển gen vào callus a. Nuôi cấy vi khuẩn làm vectơ chuyển gen
Agrobacterium tumefaciens mang plasmid có các gen cần chuyển đã được chuẩn bị sẵn
Nuôi một khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid cần chuyển trong 10ml môi trường LB (lỏng) có bổ sung 50 mg/l kanamicin và glycerol 2% nuôi lắc 225 vòng/phút ở 280C trong thời gian 18 – 24 giờ (OD260/280 = 0.3).
Ly tâm Agrobacterium tumefaciens với tốc độ 4500 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn Agrobacterium rồi hòa trong 4ml môi trường nuôi cấy có chứa acetosyringone 250µM.
Chuyển lại hỗn hợp này vào 100ml môi trường LB (lỏng) có bổ sung 50 mg/l kanamicin và acetosyringone 250µM nuôi lắc 180 - 200 vòng/ phút ở 280C trong thời gian không quá 3 giờ và được dùng để biến nạp vào callus lúa.
b. Qui trình biến nạp
Các callus từ 12 – 14 ngày tuổi có màu trắng hoặc vàng sáng và xốp được chọn và tách ra dùng để biến nạp (tiến hành trong tủ cấy vô trùng)
Đổ dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào ống falcon 50ml có chứa callus , sau đó để trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, khoảng 15 – 30 phút.
Loại bỏ dung dịch, thấm khô mô phôi bằng giấy lọc tuyệt trùng
Chuyển mô phôi sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường nhân callus thích hợp), giữ trong tối 48 – 72 giờ ở nhiệt độ 280C.
c. Loại bỏ vi khuẩn sau biến nạp
Các callus được biến nạp sau 48 – 72 giờ đồng nuôi cấy tiến hành rửa mô phôi để loại bỏ vi khuẩn
Rửa mô phôi bằng nước cất khử trùng 3 – 5 lần
Ngâm mô phôi vào nước cất khử trùng có bổ sung 500mg/l carbenicilin + 350mg/l claforan trong 5 phút
Rửa lại bằng nước cất khử trùng 3 – 5 lần có tác dụng loai bỏ vi khuẩn và kháng sinh
Thấm khô mô phôi bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển chúng sang môi trường nhân callus (N) có bổ sung 500mg/l carbenicilin + 350mg/l claforan. Sau một tuần thấy callus không bị nhiễm khuẩn trở lại thì cấy chuyển sang môi trường N không có kháng sinh và tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần nữa tạo điều kiện cho các mô phôi đã được chuyển gen tiêp tục phân chia làm tăng số lượng tế bào biến nạp sẽ dễ dàng tái sinh hơn trong môi trường chọn lọc.