VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
7.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR do Kary Mullisvaf cs, phát minh và lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1985. Đây là phương phàp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen. Phản ứng chuỗi trùng hợp thật sự đã đem lại một cuộc cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật PCR đã làm đơn giản hoá các quy trình công nghệ sinh học thậm chí còn tạo ra nhiều khả năng mới. Đây là một kỹ thuật in vitro cho phép nhân một vùng DNA đặc trưng nằm giữa hai vùng trình tự DNA đã biết. Trong phản ứng PCR cần có: đoạn khuôn, đoạn mồi, enzym polymerase chịu nhiệt, các nucleotid và dung dịch đệm.
Đoạn khuôn (template): có thể là đoạn mạch đơn hoặc mạch đôi của mỗi DNA hay ARN, thường dài từ 300bp trở lên được biết trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Mặt dù kích thước của DNA khuôn nhìn chung không phải là yếu tố quan trọng nhưng nếu dùng DNA hệ gen có phân tử lượng cao người ta thường cắt chúng thành những đoạn nhỏ hơn bằng các enzym giới hạn tại những vị trí xác đinh NotI hay Sfil. Thông thường lượng DNA làm khuôn cho mỗi phản ứng nên sử dụng dưới 1μg đối với DNA tổng số và dưới 50ng đối với DNA tách dòng.
Đoạn mồi primer: là những đoạn oligonuleotide mạch đơn dài 6 - 100bp, có trình tự bazơ của hai đầu đoạn khuôn mẫu. Nó được sử dụng như chất mồi để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA các đoạn mồi cần mang tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Mồi càng dài, khả năng tổng hợp chính xác đoạn DNA đích càng lớn. Nói chung các đoạn mồi thường từ 20 - 30bp, với độ dài này, nhiệt độ đính mồi được sử dụng hợp lý. Hơn nữa cặp mồi phải được thiết kế sao cho trình tự của chúng không được bổ trợ lẫn nhau. Ngoài ra số lượng 4 loại bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, tránh
những vùng trình tự không bình thường như polypurine polypyrimidine hay trình tự lặp đi lặp lại.
Các Nucleotide (dNTP): là một hỗn hợp của 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Ngoài ra người ta có thể sử dụng một số nucleotide đã được gắn thêm biotin hoặc digoxigenin tùy thuộc vào mục đích sử dụng sản phẩm PCR. Nồmg độ của dNTP thường dùng khoảng 100μM, tuy nhiên với nồng độ dNTP thấp (10- 100μM) thì Taq DNA polymerase hoạt động chíng xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối ưu của chúng phụ thuộc rất nhiều yếu tố như nồng độ MgCl2, nồng độ đoạn mồi, độ dài của sản phẩm được khuyếch đại, số chu kỳ của phản ứng.
Enzym DNA polymerase chịu nhiệt: vì phản ứng PCR có giai đoạn cần nhiệt độ cao tới hơn 900C nên phải sử dụng enzym DNA polymerase bền vững với nhiệt độ. Người ta đã phát hiện một số enzym đáp ứng đòi hỏi này như VentTMDNA polymerase, Pfu DNA polymerase, UIT maTMDNA polymerase, thông dụng nhất là Taq DNA polymerase. Enzym này được tách từ vi khuẩn Thermus acquaticus sống ở suối nước nóng 940C - 1000C. Taq DNA polymerase có trọng lượng phân tử 94 kDa, có hoạt tính 5’-3’
exonuclease và hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 70 - 800C. Trong một giây trung bình nó có thể gắn được 75 nucleotide.
Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tuỳ theo loại enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg++. Nó hình thành một phức hệ hoà tan với dNTP, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP, ngoài ra nó còn xúc tác cho enzym Taq DNA polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi và tăng khả năng gắn của đoạn mồi vào khuôn. Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5,0mM, nồng độ tối ưu là 1,0 - 1,5mM. Tuy nhiên trong một số trường hợp, nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết. Nhìn chung nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài
Mg++ còn có một số chất như AMSO, DMSO, formalmide được thêm vào nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước lớn.
• Phản ứng PCR diễn ra như sau :
Bước 1: 930C - 1000C làm biến tính DNA sợ đôi, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ và hai mạch đơn tách nhau ra. Nếu tỷ lệ G + C > A + T thì nhiệt độ càng phải cao.
Bước 2: 270C - 650C: đoạn mồi gắn vào khuôn DNA sợi đơn theo nguyên tắc bổ trợ giữa các bazơ nitơ.
Bước 3: 720C - 750C: enzym Taq DNA polymerase hoạt động quá trình tổng hợp DNA diễn ra trên những đoạn có mồi gắn vào. Ở nhiệt độ này, Taq DNA polymerase hoạt động chính xác với tốc độ cao. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của đoạn DNA cần tổng hợp.
Đó là một chu kỳ của phản ứng PCR thông thường được lặp lại từ 20 - 30 lần. Sau mỗi chu kỳ, giai đoạn 720C được tăng thêm từ 1 - 2 phút lượng primer giảm dần khi số chu kỳ tăng lên, hơn nữa enzym DNA polymerase hoạt động ngày càng kém do tác động của nhiệt độ. Và ở vòng cuối cùng, giai đoạn này được tăng thêm vài phút để tất cả các mạch DNA nếu bị tổng hợp thiếu hụt sẽ được tổng hợp hoàn toàn.
Như vậy mỗi vòng lượng DNA đích lại tăng lên gấp đôi, sau n vòng sẽ có 2n phân tử DNA. Tuy nhiên phải tính toán và dự toán trước lượng DNA cần tổng hợp để có lượng primer vào phù hợp (thường 108 phân tử primer).
Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần thời gian ngắn (khoảng vài giờ) đã cho một lương lớn DNA mong muốn. Đây thực sự là một phương pháp hiện đại, được dùng để xác định sự có mặt của gen trong tế bào với độ chính xác cao.
CHƯƠNG II